目的:以肠上皮层中的隐窝细胞团整体作为实验的主要研究对象,通过体外培养隐窝细胞团、分离培养单个肠干细胞,观察、分析隐窝在体外增殖能力产生差异性的原因,并研究和探讨隐窝、肠道干细胞与上皮细胞三者之间的内在联系。方法:1.组织块法,胶原酶酶/中性蛋白酶混合消化法,EDTA螯合法分离胎鼠肠上皮,观察不同分离方法下肠隐窝的暴露程度及完整性对原代肠上皮培养效果的影响。2.利用螯合法分离C57成年鼠隐窝细胞团,并建立肠类器官三维培养体系;跟踪隐窝细胞团生长分化过程,并同时对肠上皮层中的隐窝细胞团和体外培养的隐窝细胞团中含有Lgr5标记的细胞及其分化细胞进行染色鉴定。3.分别同时对螯合分离小鼠肠隐窝细胞团以及培养成功的类器官进行回收破坏或再次消化,释放肠干细胞或使肠干细胞失去与隐窝细胞团的联系。通过免疫磁珠法分离的单个Lgr5细胞或含有Lgr5细胞的细胞团,对Lgr5的生长进行跟踪观察。结果:1.通过不同的分离方法分离出的肠上皮细胞,结果表现出活性的明显差异,并且这种差异与分离出的肠隐窝的暴露程度、完整性有密切的相关联系。在胶原酶酶/中性蛋白酶混合消化法分离出聚集的小细胞团更能生长出大量的上皮细胞;组织块法因隐窝暴露的程度不够获得更多的是成纤维细胞;EDTA螯合法对胎鼠的肠上皮伤害较大,导致细胞不能在普通培养基中贴壁,不能获得大量上皮细胞。2.成功的分离出完整的隐窝细胞团,并在三维培养体系中形成可稳定长期传代的类器官(Organoid)。隐窝细胞团上在分离初期随时间增长而体积膨胀,分化系细胞在3至5天左右逐渐增加。后期细胞总数目急剧增加并脱落长出新的类器官。3.成功的分离出带有磁珠标记的Lgr5细胞,并可以观察到单个Lgr5细胞初期变圆变亮变大,随之进行不对称分裂,一定天数后,分裂的细胞将不在分化,但无论如何都无法观察到单个Lgr5细胞或脱离隐窝细胞团联系的Lgr5形成隐窝或类器官。结论:1.肠上皮在普通培养基中的培养十分依赖与隐窝细胞团。尽管胎鼠没有真正意义上的隐窝细胞团结构,但破碎的肠上皮细胞团或单个悬浮细胞通常不能形成肠上皮细胞集群。2.肠道干细胞,即Lgr5细胞,具有分化成不同终末肠上皮细胞的能力,但需要隐窝细胞团的支持。一旦失去与隐窝细胞团的联系,Lgr5细胞分化能力将变得十分有限,同时单个Lgr5无法单独分化形成隐窝细胞团或类器官结构。3.三维培养体系下的类器官上的Lgr5细胞较肠上皮组织,数量明显增加。根据相关研究报道,类器官上的细胞在遗传物质上具有长期可靠的稳定性,体外培养和传代对类器官遗传物质影响甚微。因此,这种培养方式是一种优秀的研究肠干细胞功能的方法,同时也可以作为炎症、肿瘤、肠道菌群以及其他相关研究方向良好的模型载体。