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第一部分安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织代谢组学变化的影响背景与目的:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎症性肠病,近年来探究其发病机制及寻找有效防治药物,进展仍然有限。安肠汤是临床应用和研究20余年治疗UC的中药复方,临床疗效肯定。安肠汤与UC的相关研究已有一定研究基础,但安肠汤治疗UC的作用机制仍未明确。代谢组学及肠道微生态是近年最为关注的研究热点,但两者结合在UC中的研究报道甚少。本研究采用代谢组学来探索安肠汤治疗UC的作用机制。方法:1.采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模,TNBS剂量90mg/kg,建立UC大鼠模型。2.选择最佳方案造模,随机分为模型组,丽珠肠乐组、美沙拉嗪组(阳性药物对照组),安肠汤低、中、高剂量组(治疗组)。3.各组分别在治疗后第5、10、15天各处死1/3存活大鼠,实验期间观察大鼠一般情况及粪便情况,进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分;取大鼠黏膜组织进行病理分析,以结肠损伤指数(colon macroscopic damage index,CMDI)评判大鼠黏膜损伤情况,Geboes指数评价结肠黏膜组织病理学情况;取病变结肠黏膜组织进行气象色谱-质谱检测(GC-MS),并采用主成分分析法、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),最后采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(阈值>1),并结合t检验的P值(P<0.05)来寻找差异性代谢物。结果:1.UC大鼠模型在疾病症状、结肠损伤和病理表现上均与UC疾病表现基本一致,造模后10天模型表现最佳。2.检测到的色谱图与质谱库进行匹配鉴定,得到准确定性的代谢化合物47个,安肠汤治疗组与阳性药物对照组均对UC大鼠均有治疗作用。3.经差异物筛选鉴定,最终得到UC大鼠病变结肠黏膜潜在代谢标志物10个,分别为腺嘌呤、胞嘧啶、尿苷、甘氨酸、葡萄糖、木糖、β-丙氨酸、甘露糖、乳酸、肌氨酸。4.安肠汤可降低腺嘌呤、胞嘧啶、尿苷、乳酸、甘氨酸和葡萄糖含量,提升甘露糖、木糖、肌氨酸和β-丙氨酸含量,回调幅度较阳性药物组明显(P<0.05),其中安肠汤中剂量组的回调幅度最佳。结论:1.采用2,4,6-三硝基苯磺酸液建立UC大鼠模型可行,安肠汤和美沙拉嗪、丽珠肠乐对UC大鼠均具有治疗或缓解作用。2.UC大鼠结肠黏膜组织中存在10种内源性差异性代谢物:腺嘌呤、甘氨酸、胞嘧啶、尿苷、甘露糖、乳酸、β-丙氨酸、葡萄糖、肌氨酸和木糖,它们有可能作为诊断UC的潜在分子代谢标志物。3.安肠汤可能是通过降低腺嘌呤、胞嘧啶、尿苷、乳酸、甘氨酸和葡萄糖含量,提升甘露糖、木糖、肌氨酸和β-丙氨酸含量来调节肠道内微生态。4.安肠汤治疗组对UC大鼠10种内源性差异性代谢物调节作用相对优于阳性药物组。第二部分安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群变化的影响背景与目的:近年来认为UC的发病机制与遗传、免疫、肠道微生态等因素可能有着密切关联。肠道菌群、乙酸、内毒素均是肠道微生态的重要组成部分,肠道微生态的稳定对于维持正常肠道功能至关重要,而肠道微生态失衡可能是UC的发病机制之一。本研究通过对比UC大鼠肠道菌群及乙酸、内毒素变化,探索UC大鼠的肠道微生态特征及安肠汤干预机制。方法:1.按照试验一采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模法进行造模并分组,造模后第10天开始灌胃,灌胃7天后处死大鼠并取材。2.取病变部位结肠内容物提取粪便细菌基因组DNA,采用SYBRGreen荧光染料法对提取物进行各菌属实时荧光定量PCR检测,各组菌属含量采用Delta-deltaCt相对定量法定量并制作柱状图直观分析;以液相色谱法检测乙酸含量;鲎试剂法检测大鼠肠道内毒素含量。结果:1.UC模型组大鼠肠道菌群变化:与正常对照组相比,UC模型组在乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌属、脆弱拟杆菌属、单形拟杆菌、多形拟杆菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌中表达含量明显降低(p<0.05),在拟杆菌属、梭杆菌属、肉毒杆菌、艰难杆菌、吉氏拟杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌中则表达含量明显升高(p<0.05)。2.美沙拉嗪组和丽珠肠乐组大鼠肠道菌群变化:与UC模型组相比,美沙拉嗪组和丽珠肠乐组在乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌属、脆弱拟杆菌属、多形拟杆菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌中表达含量明显升高(p<0.05);在单形拟杆菌中,美沙拉嗪组较UC模型组表达含量升高无明显差异(p>0.05),而丽珠肠乐组较UC模型组表达含量明显升高(p<0.05);在梭杆菌属、肉毒杆菌、艰难杆菌、吉氏拟杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌中美沙拉嗪组与丽珠肠乐组相对表达含量较UC模型组明显降低(p<0.05);在拟杆菌属中,美沙拉嗪组较UC模型组降低无差异(p>0.05),而丽珠肠乐组较UC模型组明显降低(p<0.05)。3.安肠汤各组大鼠肠道菌群变化:与UC模型组相比,安肠汤各组在乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌属、脆弱拟杆菌属、多形拟杆菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌中表达含量明显升高(p<0.05);在梭杆菌属、肉毒杆菌、艰难杆菌、吉氏拟杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌中表达含量明显降低(p<0.05);在单形拟杆菌中,安肠汤低剂量组较UC模型组升高无明显差异(p>0.05),而中剂量组和高剂量组较UC模型组明显升高(p<0.05)。4.安肠汤各组组间大鼠肠道菌群变化:安肠汤中剂量组在乳酸杆菌、双歧杆菌、梭杆菌属、脆弱拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌、肉毒杆菌、普通拟杆菌、艰难杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌较其他两组更明显接近空白对照组(p<0.05),而高剂量组在拟杆菌属、梭菌属、卵形杆菌、吉氏拟杆菌则较其他两组更明显接近空白对照组(p<0.05)。5.安肠汤中剂量组与美沙拉嗪组、丽珠肠乐组肠道菌群变化对比:安肠汤中剂量组的表达含量在乳酸杆菌、脆弱拟杆菌、吉氏拟杆菌中较丽珠肠乐组更明显接近空白对照组(p<0.05),在双歧杆菌、梭菌属、单形拟杆菌、肉毒杆菌中较美沙拉嗪组更明显接近空白对照组(p<0.05),在大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、艰难杆菌、普通拟杆菌、卵形杆菌、多形拟杆菌和拟杆菌属中的相对表达含量较美沙拉嗪组和丽珠肠乐组均更明显接近空白对照组(p<0.05)。6.乙酸和内毒素变化:模型组明显高于空白对照组和各治疗组﹙p<0.05﹚,但各治疗组间比较均无明显差别﹙p﹥0.05﹚结论:1.UC大鼠肠道菌群变化具有明显差异性和特征性,双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱拟杆菌属、梭菌属、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌中相对表达含量降低;艰难杆菌、拟杆菌属、肉毒杆菌、梭杆菌属、粪肠球菌、吉氏拟杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌中则相对表达含量升高,这种变化可能在UC的发病中可能起到重要作用。2.安肠汤对UC大鼠总体肠道菌属具有明显的调节作用,在总体上与美沙拉嗪和丽珠肠乐具有一致性,调控幅度相对优于美沙拉嗪组及丽珠肠乐组,安肠汤对UC肠道菌群的调控作用可能是其治疗UC的作用机制。3.安肠汤中剂量相较高剂量组和低剂量组对UC大鼠疾病症状和肠道菌群具有更显著的调节作用,或许提示适当上调临床应用剂量是合适的。4.UC大鼠的乙酸和内毒素变化可能是UC发病原因或表现特点,美沙拉嗪、丽珠肠乐及安肠汤对两者均有一定的调节意义,但各组间的调节作用没有明显差异。