复方中药筛选及其对不同源大肠杆菌的体外抑菌效果探索

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禽大肠杆菌病是严重危害养禽业的细菌病之一,主要依赖于抗生素防治,但大肠杆菌极易产生耐药性,且其耐药性可在人和动物间传播,对人类健康和公共卫生安全造成了巨大危害。超级大肠杆菌的发现和多重耐药菌株的不断报道为世界敲响了警钟,为此很多国家禁止在动物饲料中长期添加抗生素,寻找抗生素替代品已迫在眉睫。中药作为传统医药,广泛应用于疾病治疗,在抗菌功效方面存在协同、相加等关系,且其抑菌效果因大肠杆菌分离株不同而存在差异。为了明确中药抑菌效果与大肠杆菌分离株间的关系,本论文基于不同源大肠杆菌的特性(耐药基因和毒力基因携带情况、系统进化群)研究了单味中药和组方药的抑菌效果,并就分离株特性与中药抑菌效果间的关系进行了探讨,以期为中药抗菌治疗的研究奠定理论基础。首先,本研究从昆明市农贸市场鸡肝、花鸟市场虎皮鹦鹉粪样和昆明动物园孔雀粪样中分离鉴定了大肠杆菌,并对分离株的12种毒力基因和22种耐药基因的携带情况进行检测。其次,根据不同来源(包括保存的致病菌株)分离株特性,从中筛选出30株大肠杆菌,采用二倍稀释法测定了18种中药醇提成份的最小抑菌浓度,利用棋盘法测定了联合中药的抑菌效果,并自拟了2种组方。最后,本研究对分离株基因携带数量、模式及系统进化群与中药抑菌效果间的相关性进行了分析。研究结果如下:本研究共分离得到613株细菌,最终鉴定出225株大肠杆菌。分离株毒力基因检测表明:traT基因检出率最高,为99.67%;papC基因检出率最低,为20.13%,tsh、papC、cvaC 3种毒力基因的检出率在60.00%以下;其余毒力基因检出率均在60.00%以上。不同来源大肠埃希氏菌毒力基因检出率存在差异。鸡肝分离株毒力基因检出率高于粪样分离株,而发病鸡鸡肝分离株检出率高于农贸市场鸡肝分离株(papC基因除外)。分离株耐药基因检测表明:OXA、SHV两个耐药基因检出率小于40%,其余耐药基因的检出率均在40%以上。Gyra(QRDR)基因检出率最高,为99.34%;SHV基因检出率最低,为11.55%。不同来源大肠杆菌耐药基因的检出率存在差异。除OXA、SHV两种耐药基因外,其余耐药基因在发病鸡鸡肝分离株中的检出率最高;50%的耐药基因在孔雀源大肠杆菌中检出率最低。18种中药的抑菌效果表明:6味中药(诃子、地榆、乌梅、石榴皮、枳壳和芦荟)的抑菌效果较好。药物联合效果表明:五味子、乌梅、枳壳、诃子、石榴皮两两联合,表现为协同或相加作用,且枳壳与乌梅的联合效果最好;白头翁、秦皮、地榆、枳壳、芦荟两两联合,表现为相加或无关作用,而秦皮与地榆的联合效果较好。通过牛津杯法和药平板稀释法对2种自拟组方药进行筛选,结果表明:复方一的抑菌效果较好,抑菌圈直径为22.48 mm,最小抑菌浓度为3.25mg/mL。相关性分析结果表明:分离株携带较多的毒力基因和耐药基因时,中药对其具有较好的抑制或杀灭效果,反之,中药对其效果较差;就优势基因携带模式而言,中药对这些菌株亦有较好的抑制或杀灭效果。分离株系统进化群与菌株携带的毒力基因数、耐药基因数以及中药对菌株的抑菌效果间不存在相关性。以上研究结果为进一步展开中药抗菌作用的研究奠定良好的基础,也为复方中药的开发利用提供参考和依据。
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