研究背景口腔癌是人体中常见的恶性肿瘤,被列为全球十大肿瘤之一。据统计,世界范围内口腔癌患者每年新增约350,000人,死亡约170,000人。在中国,每年新增患者约48,000人,死亡患者约22,000人,并且有发病率逐年上升、发病年龄逐渐年轻化的趋势。其中口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈部恶性肿瘤中最为常见的肿瘤之一,约占头颈部肿瘤的约80%。OSCC具有恶性程度高、易转移、易复发以及预后差等特点,5年生存率仅为50%左右,更是有约20%的病人在初次治疗两至三年内出现局部复发以及淋巴结转移,使得患者的生存时间大大降低,给患者带来了极大的身体和心理上的痛苦。血管生成(angiogenesis)是人体生长发育的关键过程,在伤口愈合、月经周期和怀孕等生理状态下均会出现。当与血管生成相关的促进因素和抑制因素之间的平衡被打破时,血管生成进程会被打乱,从而引起包括肿瘤在内的多种疾病,严重威胁人类的健康。并且,血管生成是公认的包括OSCC在内的实体肿瘤赖以生长的基础,是肿瘤组织增殖、侵袭和转移的关键,也是实体肿瘤最具标志性的特征之一。因此,探索血管生成的机制以及调控新生血管的生成,已经成为肿瘤治疗的主要口标和亟需解决的重要问题。随着对血管生成认识的不断深入,人们发现免疫细胞如单核巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和白然杀伤细胞等,除了已知的免疫功能外,还大量参与肿瘤的血管生成。其中单核细胞亚群因其在调节血管形成和重塑中起关键作用而备受关注。大量的研究证实,在生理以及病理状态下,尤其是在肿瘤中,单核细胞是早期通过自身趋化受体和病原识别受体从血液中迁移到组织中,参与血管生成调节的重要细胞之一。单核细胞中的一个亚群可以表达血管生成素受体TIE2,人们把它们称为TEM(TIE2-expressing monocytes)。TEM能够聚集在炎症以及肿瘤的血管周围,表达促血管生成因子,降解基底膜,促进血管发芽和内皮细胞迁移,对血管生成起到直接的促进作用。甚至TEM自身可以向成血管方向转化,通过表达内皮细胞相似的标记物与VEGF反应形成毛细血管样结构,可代替真正的内皮细胞,形成成熟的血管。巨噬细胞是有机体对抗感染的第一道防线,能够清除机体发育以及修复过程中的死亡细胞。除此之外,调节血管生成也是巨噬细胞的重要功能之一。大量研究证明,从机体发育到成体组织再生再到疾病的发生发展,巨噬细胞几乎存在并参与其中血管生成的各个阶段。渗透到肿瘤中的巨噬细胞人们称其为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)。在OSCC中发现有大量的TAM浸润,并且参与OSCC的血管生成。TAM也是较早存在于肿瘤部位的免疫细胞,是打开肿瘤血管新生的“开关”。TAM表达多种促血管发生和调节血管生成的因子,如VEGF-A、TNF-α、IL-8等,从而促进肿瘤细胞的增殖、血管的生成以及肿瘤的恶化和转移。单核巨噬细胞因其在血管生成中的重要作用,在肿瘤治疗中受到重点的关注。但是,目前靶向调控单核巨噬细胞血管生成的治疗策略未取得实质性进展,其中一个重要原因在于其调节因素和机制尚未完全阐明。因此,探索单核巨噬细胞调控血管生成的机制,能够加深对血管生成的理解,并有助于为临床上以单核巨噬细胞为靶细胞治疗包括肿瘤在内的多种疾病提供有力的理论支撑。近年来越来越多的体内和体外研究证实,驱动蛋白家族成员在毛细血管以及血管生成的过程起着重要作用。驱动蛋白超家族蛋白(kinesin superfamily proteins,KIFs)是一种分子马达驱动蛋白,是细胞中独特的运输系统。KIFs主要位于真核细胞内,使用微管(microtubule)作为“轨道”来运输“货物(cargos)”。它们利用ATP水解产生的化学能提供运动力,进行细胞内的运输,维系生命体的存活。Kif4是驱动蛋白超家族成员之一,参与染色体稳定、DNA修复、胞质分裂、神经细胞的存活和白发性收缩等生理过程,并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。近年来的研究发现,Kif4参与血管的生成与调节。例如,在VEGF-A的刺激下,血管内皮细胞中的Kif4表达显著上调。在人肝细胞癌中,Kif4的表达上调与肿瘤血管定位有关,并且在肿瘤的血管侵犯位置表达最强。在单核巨噬细胞中已证实有多种KIF家族成员的表达。它们在调节单核巨噬细胞的多种生物学行为如迁移、侵袭等中发挥重要作用。然而Kif4在单核巨噬细胞中的功能如何,是否参与单核巨噬细胞对血管生成的调控目前尚无相关报道。因此,阐明其作用及机制将为临床上以单核巨噬细胞为靶细胞的肿瘤治疗提供新的数据及干预策略。基于以上现象及问题,本课题组拟使用RAW264.7单核/巨噬细胞,利用基因转染技术、基因组表达谱芯片检测技术、形态学观察、流式细胞分析技术、RT-PCR、免疫蛋白印迹、酶联免疫吸附测定等方法,探究Kif4在单核巨噬细胞中的功能,探索其是否介导RAW264.7单核/巨噬细胞的血管生成调控,并初步探讨其中的分子机制。通过此系列研究,我们希望能对单核巨噬细胞在血管生成调控中的作用有更深的了解,对驱动蛋白Kif4的功能有更新的认识,为肿瘤的治疗提供新的思路。第一部分基因组表达谱芯片揭示Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞的作用目的:筛选出最为有效的抑制RAW264.7单核/巨噬细胞中Kif4基因的小干扰RNA,采用基因组表达谱芯片技术,通过与对照组对比,将si-Kif4组的差异基因进行功能分析和生物通路分析,揭示Kif4在RAW264.7单核/巨噬细胞中的作用。方法:1.RAW264.7细胞的培养:取出液氮中保存的小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞复苏,放入温度37℃、95%湿度、5%CO2的孵育箱中进行培养,待细胞处于对数生长期时用于实验。2.检测小干扰 RNA(small interfere RNA,siRNA)转染效率:采用阳离子脂质体法进行转染,按照Invitrogen公司LipofectamineTM RNAi-MAX试剂说明书操作。将使用绿色荧光FAM标记的阴性对照小干扰RNA(negative control siRNA,si-NC)转入 RAW264.7 细胞。6h 后,在同一视野下,使用荧光倒置显微镜对比亮视野和荧光视野中,细胞体内是否有绿色的荧光,来确定siRNA是否转染进入细胞体内。3.检测Kif4 siRNA对RAW264.7细胞中Kif4 mRNA的敲减效率:用 Kif4-siRNA#1、Kif4-siRNA#2、Kif4-siRNA#3 转染 RAW264.7 细胞,对照组使用Mock组(只加入LipofectamineTM 2000),si-NC组(转染进阴性对照的小干扰RNA)。转染24h后,提取各组细胞总RNA,RT-PCR检测Kif4基因的敲减率,筛选出敲减效率最高的Kif4 siRNA(定义为si-Kif4组)后续实验使用。4.提取RNA的质量检测:TRIzol 法提取 si-NC 组和 si-Kif4 组细胞的总 RNA,NanoDrop ND-1000 分光光度仪上读取OD230,OD260和OD280值,计算浓度并评估纯度,琼脂糖电泳对提取的RNA进行质量进行检测(实验重复三遍)。5.基因组表达谱芯片对差异基因进行分析:使用 Mouse Gene Expression 4X 44K Microarray V2 芯片检定出差异基因,使用 Agilent Feature Extraction software(version 1 1.0.1.1)对采集到的芯片图像进行分析,使用GeneSpring GX v12.1软件包进行分位数标准化和后续数据处理。差异表达基因的判断标准:基因差异倍数≥1.5且P<0.05。采用箱形图展示所有样品的强度分布,散点图和火山图展示差异表达基因。对差异表达基因进行 Gene Ontology(GO)功能分析和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)生物通路分析。结果:1.转染FAM标记的si-NC 6h后,在荧光显微镜下观察,可见RAW264.7细胞体内有绿色的荧光,表明带有绿色荧光标记的FAM si-NC已转染进入到细胞内。2.通过RT-PCR分析测定siRNA对Kif4 mRNA的敲减作用,结果显示转染Kif4-siRNA#3的RAW264.7细胞中Kif4基因表达有显著的抑制作用(P<0.01),敲减效率达60%,我们将其定义为si-Kif4组,并用于后续实验。3.NanoDrop ND-1000分光光度仪分析显示,所有的样品ODA260/A280比值在1.8到2.0之间,ODA260/A230的比值到大于1.8,电泳图中28S、18S条带清晰,且无DNA杂带,各组样品中强度分布相似,表明RNA样品质量较好,适于芯片分析。4.数据分析显示si-NC组和si-Kif4组之间有1216个基因差异表达,其中上调240 个,下调 976 个。富集到 GO Biological Process 805 项,GO Cellular Com-ponent 93 项,GO Molecular Function 163 项,KEGG pathway 23 条,主要富集在细胞的生长、存活、免疫应答、脂质代谢、细胞吞噬、溶酶体的代谢等方面。5.差异基因中发现与单核巨噬细胞血管生成调节相关的VEGF-A下调1.63倍(P=6.29E-04)、VEGFR1下调1.82倍(P=0.0052)并且细胞中“胰腺癌通路”(ID:mmu05212)中的AKT信号通路受到显著抑制(P=0.0315),这可能与Kif4参与单核巨噬细胞血管生成调控相关。这些差异基因和信号通路的变化将为后续的实验提供信息基础。基因组表达谱芯片结果提示,Kif4能够参与RAW264.7单核/巨噬细胞对多种生物学功能,如细胞的生长、存活,固有免疫和抗原提呈、脂质代谢以及吞噬作用中溶酶体的代谢功能等的调控,并且发现与血管生成相关的VEGF-A、VEGFR1基因和AKT信号通路改变,将在后续实验中验证。第二部分Kif4介导的RAW264.7单核/巨噬细胞对人脐静脉内皮细胞成管作用的影响目的:探讨Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞形态、增殖以及细胞表面共刺激分子CD11c、CD80表达的影响,并观察转染si-Kif4的RAW264.7单核/巨噬细胞上清对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成管作用的影响。方法:1.观察转染si-Kif4后RAW264.7细胞的形态变化:RAW264.7细胞分别转染si-NC以及si-Kif4 24h、48h后,倒置显微镜下观察细胞形态是否变化。2.检测各组细胞表面共刺激分子CD1 1c、CD80表达的变化:转染RAW264.7细胞48h后,Mock组,si-NC组以及si-Kif4组分别收集细胞约1-2X 104个,用冷PBS冲洗,加入单克隆CD11c、CD80抗体以流式细胞术(flow cytometry)检测细胞表面CD11c、CD80的表达情况。3.MTT法检测各组细胞的增殖活性:分别在RAW264.7细胞转染后第1、2、3、4天时,使用MTT法检测Mock组,si-NC组以及si-Kif4组的细胞增殖情况。4.HUVECs成管实验:使用96孔板,每孔加入50μl Matrigel胶。待Matrigel胶凝固后,以2×104细胞/孔的密度将HUVECs接种于96孔板中。转染RAW264.7细胞48h后,收集Mock组、si-NC组以及si-Kif4组的细胞上清,以200μl/孔加入96孔板中,并置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。8h后观察不同组HUVECs的成管情况。结果:1.RAW264.7细胞分别用si-NC以及si-Kif4转染24h、48h后,si-Kif4组细胞的形态与si-NC组相比未见明显改变。2.转染RAW264.7细胞48h后,使用流式细胞仪检测各组细胞表面协同刺激分子CD11c以及CD80的表达变化。结果显示,各组间CD11c和CD80未见明显改变。3.MTT结果表明,转染后第1天,Mock组、si-NC组、si-Kif4组细胞的增殖活性无显著差异(P>0.05),第2、3、4天时,si-Kif4组与Mock组和si-NC组相比,细胞的增殖活性显著降低(P<0.05)。Mock组和si-NC组之间无显著差异(P>0.05)。4.HUVECs成管实验结果显示,si-Kif4组细胞上清使HUVECs的成管能力与Mock组、si-NC组相比显著增强,差异具有统计学意义(P<0.01)。以上结果提示,Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞增殖,其细胞上清可抑制HUVECs的成管能力,但是对RAW264.7单核/巨噬细胞的形态以及细胞表面CD11c和CD80的表达影响不显著。第三部分Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞VEGFR1表达的调节作用及其信号通路目的:探讨Kif4对RAW264.7单核/巨噬细胞中VEGFR1表达的调节作用,探究其中参与的信号通路。方法:1.检测si-Kif4对RAW264.7细胞VEGF-A表达的影响:转染RAW264.7细胞24h、48h后,检测Mock、si-NC、si-Kif4各组细胞中VEGF-A mRNA的表达。转染48h后,收集Mock组、si-NC组、si-Kif4组的细胞上清,使用VEGF-A的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测各组细胞上清中VEGF-A蛋白的表达。2.检测si-Kif4对RAW264.7细胞中VEGFR1以及sVEGFR1表达的影响:转染RAW264.7细胞24h、48h后,提取各组细胞的总RNA,检测Mock组、si-NC组、si-Kif4组VEGFR1 mRNA的表达;转染48h后,分别收集各组细胞、细胞总蛋白和细胞上清,分析Mock、si-NC、si-Kif4组跨膜形式VEGFR1(mVEGFR1)表达的变化,以及各组总VEGFR1的蛋白的表达,使用ELISA方法检测细胞上清中sVEGFR1蛋白的分泌。3.检测si-Kif4是否通过AKT信号通路调控VEGFR1的表达:转染 RAW264.7 细胞 24h后,使用 RT-PCR 检测 Mock、si-NC、si-Kif4 组中Akt mRNA的表达,转染48h 提取细胞总蛋白,检测Mock、si-NC、si-Kif4组中Akt以及磷酸化Akt(p-Akt)的表达。转染48后,在si-NC、si-Kif4组中加入AKT信号通路激动剂胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor,IGF-1)(100 ng/ml),通过 Western Blotting 检测 Omin、15min、30min、60min时,Akt以及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达。转染 RAW264.7 细胞 24h 后,si-NC、si-Kif4 组中分别加入 IGF-1(100 ng/ml),36h后收集细胞总RNA,分析VEGFR1 mRNA的表达,同时收集细胞总蛋白分析VEGFR1的蛋白表达,收集细胞上清液,检测sVEGFR1蛋白的分泌。用流式细胞技术检测细胞表面mVEGFR1的表达。4.AKT信号通路激活后对VEGF-A表达的影响:转染 RAW264.7 细胞 24h 后,si-NC、si-Kif4 组中分别加入 IGF-1(100 ng/ml),36h后收集细胞总RNA,使用RT-PCR分析VEGF-A mRNA的表达。收集细胞上清,使用ELISA技术检测VEGF-A蛋白的分泌。结果:1.RAW264.7细胞经过si-Kif4转染24h后,VEGF-A mRNA的表达与对照组相比显著降低(P<0.05),转染48h后,VEGF-A mRNA的表达无显著变化(P>0.05)。si-Kif4组细胞上清中VEGF-A蛋白的表达与对照组相比显著升高(P<0.05)。2.RAW264.7细胞经过si-Kif4转染24h后,VEGFR1 mRNA的表达与对照组相比显著降低(P<0.05),48h后,VEGFR1 mRNA的表达无显著改变(P>0.05)。细胞膜上mVEGFR1的表达未见显著变化,总VEGFR1蛋白的表达降低(P<0.05),细胞上清中sVEGFR1的分泌降低(P<0.05)。3.RAW264.7细胞转染si-Kif4 24h、48h后,各组间Akt mRNA的表达无显著改变(P>0.05)。转染48h后,各组间Akt蛋白的表达也未见显著变化(P>0.05),但si-Kif4组p-Akt的表达与对照组相比显著降低。加入IGF-130min后,si-Kif4组p-Akt的水平开始升高,60min后仍有激动作用,但是Akt的变化不显著(P>0.05)。4.加入 IGF-1 36h 后,si-Kif4 组中 VEGFR1 mRNA 的表达显著升高(P<0.05),VEGFR1蛋白的表达增多(P<0.05)。细胞上清中sVEGFR1蛋白的表达也高于对照组,细胞表面mVEGFR1的表达显著增加(P<0.05)。5.加入IGF-1 36h后,si-NC、si-Kif4组中VEGF-A mRNA的表达变化无显著差异(P>0.05),细胞上清中VEGF-A的表达降低(P<0.05)。以上结果表明,在RAW264.7单核/巨噬细胞中,Kif4通过激活AKT信号通路,促进细胞VEGFR1 mRNA和蛋白的表达以及sVEGFR1蛋白的分泌,进而起到降低细胞外游离VEGF-A的浓度、抑制RAW264.7单核/巨噬细胞调控血管生成的作用。结论:驱动蛋白Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞的增殖,参与细胞存活、固有免疫反应、脂质代谢以及吞噬作用等生理功能的调控。通过AKT信号通路,Kif4能够促进RAW264.7单核/巨噬细胞中VEGFR1 mRNA和蛋白的表达以及sVEGFR1的分泌,进而降低细胞外游离VEGF-A的浓度,抑制单核巨噬细胞调控血管生成的作用。