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目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是骨髓造血干细胞恶性克隆性疾病。病理过程表现为髓系干细胞恶性克隆增殖,进而抑制正常造血细胞产生和生长。临床症状主要表现为发热、贫血和出血等等。目前关于AML的病因尚不明确,可能与遗传因素、环境因素、理化刺激有关。随着新型化疗药物、靶向药物的产生及骨髓移植技术的发展,AML的治疗和预后得到显著提高,但仍有大部分病人存在原发耐药、复发及预后不良,因此探讨AML的发病机制、寻找新的治疗靶点和预后相关的分子标志物迫在眉睫。CircRNA是一类特殊的具有闭合环状结构的非编码RNA,因其反向剪接成环的特殊结构,不易被RNA酶降解,在不同物种和生物进化过程中高度保守,具有组织特异性和发育过程的表达特异性。近年来关于circRNA的研究日益增多,多项研究表明,其在多种病理生理过程中发挥重要作用。尤其是在各类恶性肿瘤中,已证实circRNA发挥癌基因或抑癌基因的作用参与肿瘤的发生发展。目前关于AML和circRNA的相关性研究报道不多,circRNA在AML中的表达情况及其作用机制需进一步深入研究。多项研究表明circHIPK3在多种实体恶性肿瘤中存在明显差异表达,发挥癌基因或抑癌基因作用参与肿瘤发生进展,在部分肿瘤中可作为特异的生物学标志物评判疗效、提示预后。但circHIPK3在急性髓系白血病中的表达情况、生物学功能及作用机制尚无研究。本研究应用Realtime-PCR检测circHIPK3在急性髓系白血病患者中的表达情况,并分析表达水平与FAB分型、染色体异常、基因突变及预后情况之间的相关性;合成相应的circHIPK3干扰si RNA转染AML细胞系,通过CCK8、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,Western Blot检测细胞凋亡和周期相关蛋白的变化,探讨circHIPK3在体外对AML生物学功能的影响;通过生信分析预测与circHIPK3结合的miRNA及靶基因,双荧光素酶验证靶向结合,细胞Rescue实验等验证circHIPK3发挥分子海绵机制影响AML的生物学行为。研究方法:1.本实验收集AML患者60例,正常对照30例,应用Realtime-PCR方法检测circHIPK3表达情况,分析其与FAB分型、染色体异常、基因突变、疗效和临床预后的相关性。2.验证circHIPK3在AML细胞系中的表达情况,选取基因表达高的细胞系HL-60和U937,合成circHIPK3的si RNA瞬时转染至细胞内。通过CCK8检测细胞增殖情况、流式细胞术检测细胞凋亡和周期情况、Western Blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白,验证circHIPK3体外对于AML细胞系生物学行为的影响。3.RNA核质分离实验验证circHIPK3的亚细胞定位;应用starbase和miRDB、microrna等数据库预测circHIPK3和miR-193a-3p及miR-193a-3p与靶基因c-Kit的相互作用关系;双荧光素酶报告基因实验验证其靶向结合;通过Realtime-PCR检测AML患者骨髓单个核细胞和细胞系中miR-193a-3p和c-Kit的表达情况并分析与circHIPK3的相关性;应用Realtime-PCR及Western Blot检测circHIPK3表达变化对miR-193a-3p和c-Kit表达的影响;检测miR-193a-3p表达变化对c-Kit表达的影响;细胞Rescue实验验证circHIPK3发挥分子海绵作用,吸附miR-193a-3p,通过circHIPK3/miR-193a-3p/c-Kit轴参与AML的生物学行为。4.统计学分析。实验数据使用SPSS22.0及Graph Pad Prism 7.0软件进行统计学处理。细胞实验每组数据至少重复三次。患者样本中分类变量以率或构成比表示,差异分析使用卡方检验;连续变量应用Kolmogorov-Smirnov方法检验其正态分布性,符合正态分布的以均数±标准差表示,差异分析应用独立样本T检验;不符合正态分布的连续数据以中位数、四分位数间距表示,差异分析应用非参数秩和检验方法;采用Kaplan-Meier生存曲线进行预后分析,应用log-rank检验进行差异分析;单因素和COX多因素分析评估预后危险因素;以p<0.05表示统计学具有显著差异。结果:1.circHIPK3在AML中的表达及临床意义1.1与正常对照组相比,AML初诊患者circHIPK3的表达水平显著上调。1.2 circHIPK3的表达水平在AML的FAB、染色体分型和特征性基因突变类型中有所差异;初诊AML患者中,circHIPK3的表达水平和患者骨髓原始细胞比例和FLT3突变情况呈正相关;生存分析结果显示,AML总体患者和正常核型患者组低表达circHIPK3具有更优的总生存时间和无复发生存时间,差异具有统计学意义。单因素和多因素COX回归分析提示circHIPK3是评估AML患者预后的独立风险因素。2.circHIPK3对急性髓系白血病细胞系细胞功能的影响2.1 circHIPK3在急性髓系白血病细胞系中高表达。2.2 HL-60和U937细胞中circHIPK3表达水平相对更高,选择此两个细胞系进行si RNA敲减效率验证,其中circHIPK3 si RNA1片段敲减效率更高,选择此片段进行后续试验。2.3 CCK8实验结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞增殖能力显著减低。2.4流式细胞术结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞凋亡比例明显升高,同时Western blot结果提示凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达明显上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降。2.5流式细胞术结果显示与空白组和阴性对照组相比,si-circHIPK3组AML细胞更多的阻滞于G1期,进入S期比例明显下调,同时Western blot结果提示细胞周期蛋白cyclin D1表达明显下调。3.circHIPK3作用AML的分子机制研究3.1核质分离试验结果提示circHIPK3主要定位于细胞浆中。3.2 RNase R实验证实circHIPK3的环状结构存在。3.3 si RNA敲减circHIPK3后不影响其线性转录本HIPK3的表达。3.4 miR-193a-3p是circHIPK3的下游靶基因:生物信息学预测circHIPK3可靶向结合miR-193a-3p,miR-193a-3p在AML患者和细胞系中低表达,在患者中与circHIPK3呈负相关,双荧光素酶报告基因检测进一步确定两者靶向结合,敲减circHIPK3可以上调miR-193a-3p的表达。3.5 c-Kit是miR-193a-3p调控的下游靶基因:生物信息学预测miR-193a-3p和c-Kit靶向结合,并与circHIPK3存在共同结合位点,circHIPK3和c-Kit可竞争结合miR-193a-3p,c-Kit基因在AML细胞系和患者中明显高表达,在AML患者中和miR-193a-3p的表达呈明显负相关,双荧光素酶报告基因进一步确定两者靶向关系,过表达miR-193a-3p可以抑制c-Kit表达。3.6 circHIPK3通过靶向miR-193a-3p影响c-Kit表达调控AML的生物学行为:在AML患者中circHIPK3表达水平和c-Kit明显正相关,敲减circHIPK3后可抑制c-Kit的表达,共转染miR-193a-3p inhibitor可以部分回复circHIPK3敲减对c-Kit表达的影响,同时共转染miR-193a-3p inhibitor可以部分回复circHIPK3减低对HL-60和U937细胞的增殖、凋亡和周期的影响,Western blot结果提示凋亡和周期相关蛋白cleaved Caspase-3、Bcl-2和cyclin D1表达水平部分回复。结论:1.circHIPK3在AML患者中明显高表达,并与部分反映AML肿瘤负荷的指标密切相关,高表达circHIPK3的AML患者预后不佳,circHIPK3表达情况是评估AML预后的独立风险因素。2.circHIPK3在髓系白血病细胞系中高表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,发挥癌基因作用。3.circHIPK3发挥分子海绵作用,竞争性抑制miR-193a-3p,进而调控靶基因c-Kit,通过circHIPK3/miR-193a-3p/c-Kit轴调控AML生物学行为。