甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia KansuiT.N.Liou ex T.P.Wang的块根,始载于《神农本草经》,列为下品。其味苦,性寒,有毒,具有泻水逐饮、破积通便之功效,用于水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气逆咳喘、二便不利等症。临床上广泛用于治疗肝硬化腹水、渗透性胸膜炎、肾炎水肿以及晚期血吸虫病所致的腹水等。但是,甘遂对口腔、胃肠道、眼及皮肤粘膜等具有严重的刺激性,并有致炎、促发肿瘤等毒性,更有文献报道,甘遂对肝功能的损害仅次于关木通,上述毒性严重制约着该药的临床使用。中医传统采用醋炙来降低甘遂的毒性和刺激性,缓和其泻下作用,但对于醋炙降低甘遂毒性作用的物质基础及作用机制,尤其是醋炙降低甘遂肝毒性的物质基础及作用机制,国内外迄今尚未见明确报道。因此本论文对醋炙降低甘遂肝毒性机制进行了较为系统的研究,旨在为进一步揭示醋炙降低甘遂毒性提供依据。论文研究内容主要包括以下几部分:一、文献研究查阅相关古今文献,从肝毒性的作用机理、常见具有肝脏毒性的中药、通过降低中药肝脏毒性的方法等方面对中药肝脏毒性研究进行了较为系统的综述,为本论文制定切实可行的研究方案,确定研究考察指标及研究起点奠定了基础。二、考察了醋炙降低甘遂对人正常肝细胞L-O2的毒性及机制1.研究了甘遂不同炮制品对人正常肝细胞L-O2的增殖抑制作用。采用MTT法测定了细胞相对抑制率,并在倒置显微镜下观察了甘遂生品、清炒品、醋润品和醋炙品作用后细胞形态学的改变。实验结果显示甘遂生品具有较强的肝细胞毒性,醋炙后,毒性降低,甘遂各炮制品降低肝毒性的顺序为甘遂生品>清炒品>醋润品>醋炙品,且毒性降低效应呈一定的剂量相关性,并揭示,甘遂醋炙过程中醋润和加热两个炮制过程能够起到降低甘遂肝毒性的协同作用。2.研究了甘遂不同炮制品对人正常肝细胞L-O2的细胞周期进程和细胞凋亡效应。采用流式细胞术研究甘遂生品、清炒品、醋润品和醋炙品对L-O2细胞周期和细胞凋亡效应的影响。结果表明甘遂生品显著诱导肝细胞凋亡,醋炙后,降低肝细胞凋亡,甘遂各炮制品诱导肝细胞凋亡的顺序为甘遂生品>清炒品>醋润品>醋炙品,且毒性降低效应呈一定的剂量相关性。并揭示,甘遂醋炙过程中醋润和加热两个炮制过程能够起到降低甘遂肝毒性的协同作用。3.研究了醋炙降低甘遂对人正常肝细胞L-O2氧化损伤毒性的机理。结果表明甘遂生品能够导致肝细胞氧化损伤,醋炙后,与生品组比较,肝细胞氧化损伤各项指标均具有显著差异性(P<0.01),提示,甘遂生品对肝细胞具有明显的氧化损伤,醋炙能够显著降低甘遂致肝细胞氧化损伤的程度。4.研究了醋炙降低甘遂对人正常肝细胞L-O2凋亡的机制。结果显示甘遂生品能够显著增加人正常肝细胞L-O2的细胞核固缩、降低线粒体膜电位、促使细胞色素C(Cyt-c)释放(P<0.01,P<0.05,P<0.01);且能够显著增加细胞膜通透性(P<0.01)和上调caspase-3的表达;与生品组比较,甘遂醋炙品显著减少人正常肝细胞L-O2的细胞核固缩、增加线粒体膜电位、减少细胞色素C(Cyt-c)的释放(P<0.05),且能够显著降低细胞膜通透性(P<0.05)和减少上调caspase-3表达的量。提示,甘遂能显著诱导肝细胞线粒体凋亡,醋炙通过降低甘遂诱导肝细胞线粒体凋亡来降低肝毒性。三、考察了醋炙降低甘遂致小鼠的肝毒性及机制1.考察了甘遂醋炙前后乙酸乙酯部位致小鼠的肝毒性。正常小鼠灌胃给予甘遂和醋甘遂不同剂量的乙酸乙酯提取物,结果表明与空白对照组比较,甘遂高、中、低剂量组均能显著增加小鼠血清和肝组织中AST、ALT、LDH的含量和肝/体比值(P<0.01,P<0.001),并能明显改变肝组织病理形态;醋炙后,各剂量组与生品组比较,显著降低小鼠血清和肝组织中AST、ALT、LDH的含量和肝/体比值(P<0.05,P<0.01,P<0.001),并能明显改善肝组织病理形态。提示,甘遂生品具有显著的肝毒性,醋炙能显著降低甘遂致小鼠的肝毒性。2.考察了甘遂醋炙前后乙酸乙酯部位致小鼠肝脏氧化损伤毒性的机理。结果表明,与空白对照组比较,甘遂能够显著降低小鼠血清和肝组织中SOD活力和GSH含量(P<.01,P<0.001)、提高MDA含量(P<0.001),同时显著降低肝组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力(P<0.01);与生品组比较,醋甘遂各剂量组显著提高小鼠血清和肝组织中SOD活力(P<0.001)和GSH含量(P<0.01),显著降低MDA含量(P<0.001),显著增加肝组织中 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力(P<0.001)。提示,甘遂生品对小鼠肝脏具有明显的氧化损伤,醋炙能够显著降低甘遂致小鼠肝脏氧化损伤的程度。3.考察了甘遂醋炙前后致小鼠肝细胞的凋亡及其作用机制。结果表明,与空白对照组比较,甘遂能显著升高肝细胞凋亡指数(P<0.01,P<0.001)和促进凋亡因子Caspase-3的表达(P<0.01),同时降低抑制凋亡因子Bcl-2的表达(P<0.01),并显著升高肝组织中NF-κB和ICAM-1蛋白表达(P<0.001);醋甘遂能显著降低肝组织中细胞凋亡指数(P<0.05,P<0.001)和促进凋亡因子Caspase-3的表达(P<0.01),并显著提高抑制凋亡因子Bcl-2的表达(P<0.05),显著降低肝组织中NF-κB和ICAM-1蛋白表达(P<0.01,P<0.001)。提示,甘遂可能通过促进细胞异常凋亡和炎症坏死两条通路共同造成小鼠肝损伤,而醋炙可在甘遂所致小鼠细胞异常凋亡和炎症坏死两方面同时发挥降低毒性的作用。四、研究了甘遂毒性二萜类成分EK-O2对人正常肝细胞L-O2的毒性及作用机制1.研究了 EK-02对人正常肝细胞L-O2的毒性作用。采用CCK-8法测定了细胞相对抑制率并计算了半数抑制率IC50,并在倒置显微镜下观察EK-02作用后细胞形态学的改变,实验结果均显示EK-02具有较强的肝细胞毒性(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。2.考察了 EK-02对人正常肝细胞L-O2的细胞周期和凋亡的影响。结果显示,EK-02能显著诱导人正常肝细胞L-O2凋亡(P<0.01),且呈一定的剂量相关性。3.研究了 EK-02诱导人正常肝细胞L-02凋亡的机制。结果表明,与正常肝细胞组比较,EK-02能显著降低人正常肝L-O2细胞核Hoechst荧光强度、线粒体膜电位荧光强度、细胞色素C荧光强度(P<0.05)和显著增加细胞膜通透性荧光强度(P<0.01),并能显著上调人正常肝细胞L-O2的caspase-3,8,9 mRNA的表达(P<0.01);及Bax、AIF、Apaf-1蛋白的表达(P<0.01),并能显著下调人正常肝细胞L-O2的Bcl-2蛋白的表达(P<0.01)。提示,EK-02能通过线粒体凋亡路径来诱导肝细胞凋亡。4.采用UPLC-Q-TOF-MS分析方法研究了甘遂炮制前后EK-O2的含量变化。结果表明,与甘遂生品组比较,醋炙品中EK-O2含量显著降低,含量变化率为-60.25%。提示,醋炙能显著降低甘遂毒性代表性物质EK-O2的含量,结合前期对甘遂毒性的评价,因此推测,甘遂炮制后肝毒性的降低主要源于以巨大戟烷型二萜类化合物为代表的毒性成分量的降低。