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幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, H. pylori)是一种微需氧有鞭毛的螺旋型革兰氏阴性菌,1982年由Marshall和Warren在人体胃中首次发现。H. pylori的全球人群感染率超过50%,在发展中国家感染率更高。H. pylori的感染是慢性胃炎、胃溃疡等发生的重要危险因素,也与胃癌的发生关系密切,胃癌的死亡率在肿瘤相关疾病死亡率中居第二位。H. pylori致病因子众多,其中与肿瘤发生关系最密切的是细胞毒素相关基因致病岛(cytotoxin-associated gene pathogenicity island, cagPAI),在一半的西方型菌株和90%的东亚型菌株中均携带cagPAI9。cagPAI中编码120-140kDa大小的CagA蛋白与胃癌的发生有密切关系。为了阐明CagA蛋白在H. pylori感染导致胃癌的致病机制中的作用,本课题组构建了一株cagA基因敲除的突变菌株HP27CcagA-);经过HP27(cagA-)突变株和野生菌HP27(cagA+)分别感染胃上皮细胞,利用双向电泳和质谱分析筛选两组细菌感染引起的宿主细胞总蛋白的差异。首次发现：与突变株相比,α-烯醇化酶(ENO1)在野生菌感染组中呈高表达,提示ENO1的表达可能与CagA蛋白有关。ENO1是一种能量代谢关键酶,一些证据表明ENO1和肿瘤的发生、发展关系密切,ENO1的高表达参与肿瘤细胞的无限增殖过程,例如在神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、肺癌、肝癌和胃肠道肿瘤中ENO1都呈高表达。因此ENO1被认为是一种新的肿瘤相关蛋白。但目前,CagA蛋白对宿主细胞ENO1表达的调控研究未见报道。因此本研究通过构建CagA真核表达质粒转染人胃癌细胞系,探讨CagA蛋白是否上调细胞ENO1蛋白的表达；利用CagA去磷酸化突变体转染细胞,研究CagA蛋白磷酸化在CagA诱导ENO1高表达中的作用；最后,利用信号蛋白抑制剂研究CagA蛋白是通过哪些信号通路介导ENO1表达的调控。目的通过研究CagA蛋白对胃癌细胞ENO1蛋白表达的调控及其信号通路,探讨CagA蛋白在H. pylori感染导致胃癌发生中的作用。为进一步阐明H. pylori感染所致胃癌的分子机制和胃癌防治提供理论依据。方法1、提取HP27全基因组DNA,通过PCR扩增得到cagA基因(QD306710),并与pMD19-T载体连接；2、分别双酶切cagA基因和真核表达载体pcDNA3.1并进行定向连接,构建cagA基因真核表达载体pcDNA3.1-WT-cagA (pWT-cagA),挑取阳性单克隆进行PCR、酶切和测序鉴定；3、采用重叠延伸法PCR进行cagA基因的点突变,构建CagA蛋白的酪氨酸磷酸化位点突变载体PRCagA (B-)和PRCagA (D-),挑取阳性单克隆进行测序鉴定；4、利用幽门螺杆菌野生株感染胃癌细胞系AGS和SGC-7901,利用实时定量荧光PCR和Werstern-blot方法检测感染细胞前后的ENO1mRNA和蛋白的表达变化。5、将cagA基因真核表达载体pWT-cagA和空载体pcDNA3.1(+)分别转染AGS细胞,培养36h后,空质粒组为对照,利用实时定量荧光PCR和Werstern-blot方法检测转染后两组细胞ENO1mRNA和蛋白的表达水平。6、突变表达质粒pcDNA3.1-PRB-cagA (PRCagAB-)和pcDNA3.1-PRD-cagA (PRCagAD-)转染AGS细胞,培养36h后,空质粒转染组为对照,利用实时定量荧光PCR和Werstern-blot方法检测转染后三组细胞ENO1mRNA和蛋白的表达水平改变情况。7、用四种特异性信号蛋白抑制剂来检测与CagA介导的ENO1上调有关的信号通路。用BAY11-7082阻断NF-κB激酶活性,LY294002阻断P13K激酶活性,PP1阻断Src家族激酶活性,U0126阻断ERK1/2激酶活性,预处理AGS细胞1h,再分别用pWT-cagA和空载体pcDNA3.1(+)转染AGS细胞,培养36h后收集细胞总蛋白,用Werstern-blot方法检测ENO1蛋白的表达水平改变情况。结果1、成功扩增cagA基因,基因编码区全长为3510bp,成功构建pDM19-T-cagA质粒；2、经PCR、酶切和测序验证,成功构建了CagA蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-WT-cagA (pWT-cagA);3、成功构建CagA蛋白的酪氨酸磷酸化位点突变载体PRCagA (B-)和PRCagA (D-),测序结果显示EPIYA基序中的酪氨酸密码子TAC被定点突变为半胱氨酸密码子TGC；4、幽门螺杆菌感染胃癌细胞系AGS细胞和SGC-7901细胞,均能在mRNA和蛋白水平上调ENO1的表达；5、pWT-cagA (CagA组)和空质粒pcDNA3.1(对照组)分别转染AGS细胞后,CagA转染组较对照组ENO1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高；6、用两个磷酸化位点突变后的PR-CagA表达质粒和空质粒pcDNA3.1(对照组)分别转染AGS细胞后,发现三组ENO1的mRNA和蛋白表达水平的差异无统计学意义,结果表明CagA的磷酸化参与上调ENO1的表达。7、用特异性信号蛋白抑制剂预处理AGS细胞,Werstern-blot方法检测ENO1蛋白表达情况,结果显示,Src激酶抑制剂(PP1)和ERK通路抑制剂(U0126)能够抑制CagA诱导的ENO1表达的增加,而NF-κB通路抑制剂(BAYl1-7082)和P13激酶抑制剂(LY294002)不能抑制CagA介导的ENO1表达的上调,显示Src和ERK通路参与CagA对ENO1上调的过程。结论1、H. pylori感染能够上调胃癌细胞中ENO1mRNA和蛋白水平的表达；2、H. pylori感染上调胃癌细胞ENO1蛋白的表达是依赖于细菌的细胞毒素相关蛋白CagA;3、CagA蛋白介导的ENO1表达上调有赖于自身的酪氨酸磷酸化；4、H. pylori分泌的CagA蛋白通过Src家族激酶和MEK/ERK信号通路调控ENO1蛋白的高表达。