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第一部分Pin1基因敲减对SH-SY5Y神经细胞氧反常损伤的影响目的观察Pin1在不同时限SH-SY5Y神经细胞氧反常损伤中的表达变化,通过Pin1基因敲减,研究Pin1对细胞凋亡的影响及在线粒体凋亡通路中的作用机制,探讨Pin1在SH-SY5Y神经细胞氧反常损伤中的功能。方法(1)Pin1蛋白的细胞内定位与表达变化:将SH-SY5Y细胞分为正常对照组(Control),不同时限氧糖剥夺/再复氧糖(OGD/R)模型组(M0.3h、M12h、M24h,即OGD2h/R0.3h、12h、24h)。倒置相差显微镜动态观察细胞形态;激光共聚焦免疫荧光法分别检测SH-SY5Y细胞Pin1蛋白与线粒体标志蛋白Hsp60表达定位,Pin1与p-Bim EL蛋白的表达定位;Western blot检测Pin1蛋白在不同时限氧反常损伤中的表达变化。(2)慢病毒感染SH-SY5Y细胞:分别包装阴性对照(Scrambled)、Pin1基因敲减(Pin1-sh RNA)、外源表达Pin1基因(Flag-Pin1)慢病毒,感染SH-SY5Y细胞,通过嘌呤霉素筛选,获得稳定感染的细胞株。将病毒感染后的细胞分阴性对照组(Scrambled,Scr),Pin1基因敲减组(sh Pin1,sh P),Pin1基因敲减后外源表达Pin1基因组(sh Pin1+Flag-Pin1,sh P+F),病毒感染后OGD2h/R24h模型组(Scr+M24h、sh P+M24h、sh P+F+M24h)。RT-PCR分别检测Pin1、Bim基因表达;Western blot检测Pin1蛋白表达;MTT检测各组细胞存活率;AO/EB观察细胞凋亡;细胞免疫荧光、Western blot分别检测Pin1、p-Bim表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax的表达;JC-1检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)。结果(1)SH-SY5Y神经细胞中Pin1与线粒体标志蛋白Hsp60在线粒体中存在共表达,Pin1与p-Bim EL在SH-SY5Y神经细胞中存在共表达。OGD/R0.3h、12h、24h后,SH-SY5Y神经细胞Pin1蛋白表达逐渐升高,于复氧糖24h升至最高。(2)成功建立Pin1基因敲减和敲减后外源表达Pin1基因的SH-SY5Y细胞株,即sh P组细胞中Pin1 m RNA和蛋白表达显著下调,sh P+F组细胞中Pin1 m RNA和蛋白表达显著升高。制备OGD2h/R24h模型后,Scr+M24h、sh P+M24h、sh P+F+M24h组细胞存活率均较未造模的Scr、sh P、sh P+F组明显下降,Scr+M24h、sh P+F+M24h组细胞存活率较sh P+M24h组下降更明显。Pin1、p-Bim蛋白表达在Scr+M24h组和sh P+F+M24h组明显升高,sh P+M24h组无明显变化。Scr+M24h、sh P+M24h、sh P+F+M24h组均出现细胞凋亡与ΔΨm下降,以Scr+M24h和sh P+F+M24h组较sh P+M24h组更显著;Bax蛋白表达在Scr+M24h组和sh P+F+M24h组明显升高,sh P+M24h组无明显变化。结论(1)Pin1存在于SH-SY5Y神经细胞线粒体,并与p-Bim EL相关联。(2)Pin1蛋白表达水平随OGD2h/R0.3h、12h、24h时限改变渐次升高,于OGD2h/R24h表达最高。(3)敲减Pin1基因抑制了OGD2h/R24h后SH-SY5Y神经细胞线粒体凋亡通路的激活,使细胞凋亡减少。第二部分Pin1基因敲减对SH-SY5Y神经细胞迁移的影响目的观察Pin1基因敲减对SH-SY5Y神经细胞迁移的影响,研究Pin1的分子调控机制,探讨Pin1在神经系统发育过程中发挥的功能。方法分别包装阴性对照(Scrambled)、Pin1基因敲减(Pin1-sh RNA)慢病毒,感染SH-SY5Y细胞,通过嘌呤霉素筛选,获得稳定感染的SH-SY5Y细胞株。将病毒感染后的细胞分为Scrambled阴性对照组(Scrambled),sh Pin1实验组(sh Pin1)。RT-PCR检测敲减Pin1基因后Pin1、Vimentin、Cyclin D1、MMP2基因m RNA表达变化,Western blot检测Pin1、Vimentin、Akt、p-Akt、JNK、c-Jun、p-c-Jun(s73)、p-c-Jun(s473)蛋白的表达变化;Transwell、划痕实验检测细胞迁移变化。结果(1)成功建立敲减Pin1基因的SH-SY5Y细胞株,sh Pin1组中的Pin1 m RNA、蛋白水平均显著下调。(2)敲减Pin1基因后,Vimentin m RNA、蛋白表达均有降低。(3)sh Pin1组细胞迁移数目、迁移面积均较Scrambled组降低。(4)敲减Pin1基因对Cyclin D1 m RNA表达水平无影响,MMP2 m RNA表达有降低趋势。(5)敲减Pin1基因降低了JNK、c-Jun、p-c-Jun(s73)、p-c-Jun(s473)、Akt、p-Akt蛋白的表达。结论敲减Pin1基因可能通过降低Vimentin m RNA、蛋白表达,MMP2 m RNA表达,同时抑制c-Jun/JNK、PI3K/Akt信号通路的激活阻碍细胞迁移。这些结果对于探究Pin1在神经系统发育以及神经细胞损伤中的作用提供了前期基础。