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目的：进一步研究雷公藤内酯醇(TP)对耐顺铂人卵巢癌细胞株(COC1/DDP)的体外活性的影响,初步探讨TP对COC1/DDP体外活性影响的机制及COC1/DDP细胞株的耐药机制,为TP成为治疗晚期或耐顺铂卵巢癌的药物提供实验依据。方法：1.COC1/DDP细胞传代培养：COC1/DDP细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,将细胞密度调整至5×105/ml,置培养瓶中,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养。待细胞至对数生长期,吹打制成单细胞悬液,1000r/min,离心10min,弃上清液,更换培养基,按每瓶以5×10-5/ml密度补充液体容量至7ml接种到培养瓶内。2、MTT法检测顺铂(DDP)对COC1/DDP细胞增殖的影响：研究分实验组7个：分别含(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40)μg/ml DDP,并设空白对照组1个(只含COC1/DDP细胞完全培养),其分别作用COC1/DDP细胞24h、48h、72h之后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测每孔光吸收值(OD值)。结果可反映DDP对COC1/DDP细胞增殖的影响,同时计算DDP对细胞的抑制率及IC50值。3、MTT法检测TP对COC1/DDP细胞增殖的影响：研究分实验组8个(阴性对照组、顺铂组、低浓度TP组、低浓度TP+顺铂组、中浓度TP组、中浓度TP+顺铂组、高浓度TP组、高浓度TP+顺铂组)及空白对照组1个,其分别作用于COC1/DDP细胞24h、48h、72h之后用MTT比色法检测每孔OD值,同时计算TP对COC1/DDP细胞的抑制率4、光镜和电镜观察TP对COC1/DDP细胞形态及超微结构的影响：通过倒置光学显微镜及透射电子显微镜观察空白对照组和中浓度TP组(10ng/ml)分别作用COC1/DDP细胞24h后COC1/DDP细胞的形态和超微结构的改变。5、流式细胞术检测TP对COC1/DDP细胞凋亡率和细胞周期的影响：取对数生长期COC1/DDP细胞细胞,用流式细胞仪检测空白对照组、低浓度TP组(3ng/ml).中浓度TP组(10ng/ml)和高浓度TP组(50ng/ml)各作用24h后细胞凋亡率和细胞周期的变化。6、DNA电泳分析TP对COC1/DDP细胞DNA的影响：研究分空白对照组和中浓度TP (10 ng/ml)组,作用COC1/DDP细胞24h后,分别提取两组细胞中DNA,通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析两组细胞DNA变化情况。7、免疫组化Elivision TMplus法检测Caspase-7蛋白在TP作用后COC1/DDP细胞的表达情况：设空白对照组和中浓度TP组(lOng/ml),分别作用COC1/DDP细胞24h后,离心固定两组细胞,并按常规方法制备石蜡块,用免疫组化Elivision TMplus法检测两组细胞中Caspase-7蛋白表达差异。结果：1、COC1/DDP细胞生长曲线的确定通过观察COC1/DDP细胞的生长曲线,可以得知培养3-4天为细胞的对数生长期,以此确定取培养3-4天的细胞为研究用靶细胞。2、不同浓度DDP对COC1/DDP细胞增殖的影响：DDP对COC1/DDP细胞的抑制作用呈时间-剂量依赖性。其药物作用24h后的IC50为5.567μg/ml,作用48h后的IC50为2.866μg/ml,作用72h后的IC50为1.161μg/ml。COC1/DDP细胞完全培养基中0.5μg/ml的DDP对COC1/DDP细胞的影响忽略不计。3、TP对COC1/DDP细胞增殖的影响：TP对COC1/DDP细胞的抑制作用呈时间-剂量关系,不同浓度TP与2.5μg/ml DDP联合作用于COC1/DDP呈现协同抑制作用(P<0.05)。4、TP对COC1/DDP细胞形态结构的影响：4.1光学显微镜下观察：空白对照组的细胞增殖良好,细胞透光度强,细胞形态呈圆形或不规则。TP组细胞密度较空白组减少,剩余细胞胞体变小,细胞变扁平,细胞形态多样化,胞浆内颗粒增多,培养液背景中可见细胞碎片。HE染色可见COC1/DDP细胞异型性,核浆比增高,巨核或多核等改变。4.2电镜观察细胞超微结构的改变：空白对照组细胞呈椭圆形,细胞核为卵圆形,染色质丰富,细胞形态正常。TP组可见细胞显凋亡改变,表现为：细胞膜表面微绒毛消失,细胞膜皱缩,胞浆浓缩并出现大小不等的空泡,细胞核染色质固缩、呈新月状凝聚在核膜周边,有凋亡小体形成。5、TP作用于COC1/DDP细胞后细胞周期和细胞凋亡率的改变：不同浓度TP作用于COC1/DDP细胞24h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况,低、中、高浓度TP组均可见细胞凋亡图像,凋亡率分别为：(2.69±0.23)%、(5.30±0.18)%、(16.67±0.22)%,S期细胞分别为：(48.86±0.61)%、(45.96±0.42)%、(38.72±1.11)%,G1期细胞分别为：(35.48±0.44)%、(45.38±0.35)%、(55.34±0.67)%,G2期细胞分别为：(15.67±0.71)%、(8.66±0.28)%、(5.94±0.90)%。结果提示,TP可促进COC1/DDP细胞凋亡,使细胞停滞在G1期,随着TP浓度增加,细胞凋亡率增加,呈量效依赖关系(P<0.05)。6、TP对COC1/DDP细胞DNA的影响：TP作用于COC1/DDP细胞24h后,通过琼脂糖凝胶DNA电泳分析可见细胞凋亡特征性改变的DNA图谱“梯状”条带,而空白对照组细胞未见上述表现。7、免疫组化检测TP作用COC1/DDP细胞24h后Caspase-7蛋白表达：可见细胞浆染至棕黄色,Caspase-7蛋白呈强阳性表达。而空白对照组部分细胞浆染呈淡黄色,Caspase-7蛋白弱阳性表达。结论：1、DDP对体外培养的COC1/DDP细胞有明显的抑制作用,且与时间及药物浓度呈依赖性。完全培养基中含浓度为0.5μg/m1DDP对COC1/DDP细胞无抑制作用。2、TP对COC1/DDP有抑制作用,呈时间-剂量依赖关系。3、不同浓度TP联合2.5μg/ml的低剂量DDP对COC1/DDP细胞有协同抑制作用。4、TP可促进COC1/DDP细胞凋亡,增加细胞凋亡率,其凋亡率的增加与TP浓度呈现剂量依赖关系。TP诱导COC1/DDP细胞凋亡的可能机制是使细胞停滞在G1期,影响细胞DNA合成和有丝分裂。从分子水平观察TP通过促进细胞中DNA断裂来起效。5、在COC1/DDP细胞中,Caspase-7蛋白呈低表达,TP作用COC1/DDP细胞后,Caspase-7蛋白呈高表达,TP促进COC1/DDP细胞凋亡机制也可能与Caspase-7蛋白活性上调有关,而COC1/DDP细胞株耐药机制可能与Caspase-7蛋白活性下调有关。