阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnoea hypopnea syndrome,OSAHS)是一种临床上常见的严重危害人类健康的睡眠紊乱性疾病,其特征为睡眠过程中反复发生上气道阻塞或塌陷。由于上气道壁缺乏足够骨或软骨组织的支撑而易塌陷,其管腔大小取决于上气道扩张肌张力与上气道负压之间的平衡,因此,上气道扩张肌,尤其是颏舌肌,对维持上气道管腔体积起重要作用。目前,颏舌肌功能障碍可导致OSAHS的发生学者们已达成共识,随着人们对OSAHS研究的深入,发现呼吸暂停或低通气也会损伤颏舌肌功能,其反过来会加重OSAHS患者的上气道塌陷,进而形成一个恶性循环,最终加重OSAHS患者的病情。目前,OSAHS的治疗方法很多,包括行为治疗(如减肥、戒酒、侧卧位睡眠等)、持续上气道正压通气治疗、手术治疗、口腔矫治器治疗、电刺激治疗和药物治疗等。其中,口腔矫治器治疗属于保守、无创治疗,目前临床上治疗OSAHS最常用的口腔矫治器为下颌前移矫治器(mandibular advancement device,MAD)。美国睡眠协会推荐下颌前移矫治器作为轻、中度OSAHS患者的首选治疗方法,对于那些不愿接受或不能耐受上气道正压通气的重度OSAHS患者以及拒绝手术治疗的患者,均可作为下颌前移矫治器治疗的适应人群。下颌前移矫治器的优势在于无创、费用低、疗效好、而且戴用舒适、携带方便、患者更愿意接受,因此在临床上逐渐推广应用。临床上常应用X线检查,如头颅侧位片、CT及核磁共振来观察OSAHS患者戴入下颌前移矫治器后上气道的变化。而目前对下颌前移矫治器治疗OSAHS的研究仅限于下颌前移矫治器治疗后OSAHS患者的主观症状、睡眠质量以及上气道结构的改变。如前所述,颏舌肌功能与OSAHS关系密切,然而目前的研究大多关注颏舌肌功能异常在OSAHS发病中的作用,而对OSAHS引起颏舌肌损伤和功能障碍的研究还比较局限。由Carrera进行的两项研究均发现OSAHS会导致颏舌肌损伤和功能障碍,表现为OSAHS患者颏舌肌疲劳性明显增加。慢性间断性低氧是OSAHS的基本生理特征,有研究报道间断性低氧会损伤上气道结构以及开大肌功能。那么,OSAHS对颏舌肌功能和结构究竟有何影响?颏舌肌属于骨骼肌,肌肉的结构、纤维分型和能量代谢与其功能密切相关。线粒体做为肌肉供能的主要细胞器,可维持骨骼肌细胞正常的结构、功能和能量代谢,OSAHS对颏舌肌线粒体的结构和功能影响如何?OSAHS影响颏舌肌功能的可能生物学机制是什么?作为治疗轻、中度OSAHS的首选且受欢迎的方法,戴用下颌前移矫治器治疗OSAHS后患者颏舌肌功能、结构及能量代谢方面是否有所改善?关于以上问题的研究均未见研究报道,这些也正是本课题拟研究的主要内容。第一部分下颌前移矫治器治疗OSAHS前后颏舌肌功能的改变目的：通过应用下颌前移矫治器治疗OSAHS的动物模型观察OSAHS对颏舌肌体外收缩能力及线粒体功能有何影响,以及下颌前移矫治器治疗后变化如何。方法：1动物分组及动物模型建立30只雄性纯种新西兰大白兔[许可证号：SCXK：冀)2013-1-003],6月龄,体重3.0kg～3.5kg。随机分为三组,每组10只。①对照组：为正常组。②OSAHS组：即阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征组。③MAD组：即下颌前移矫治器组。三组动物在造模前进行仰卧位状态下上气道螺旋CT扫描(美国LightspeedGE16层型螺旋CT机)和多导睡眠监测(美国邦德Monet型多导睡眠监测系统),以排除先天性上气道狭窄或先天性OSAHS的存在,同时测定体重和进食量作为造模前基线值。OSAHS组和MAD组动物在软腭中与软硬腭交界1.5cm处黏膜下肌层注射聚丙烯酰胺水凝胶建立OSAHS模型,建模完成后,进行仰卧位上气道螺旋CT扫描和多导睡眠监测以鉴定OSAHS动物模型建立成功。建模成功后,MAD组中的OSAHS兔动物模型佩戴下颌前移矫治器,下颌前移矫治器由白凝树脂制作而成,戴入后其前斜面与上前牙成30°角,并用玻璃子粘固于两颗上前牙,同时下颌被引导前移3mm～4mm,咬合打开2mm～3mm。戴入矫治器适应3天～5天后,所有动物活动自如,可正常进食、饮水,再应用上述同样方法进行仰卧位上气道螺旋CT扫描和多导睡眠监测以评价下颌前移矫治器治疗OSAHS的效果。2仰卧位睡眠建模完成5天后,所有实验动物无进食、进水困难,每日记录体重及进食量,并且每日上午均按5ml/kg～6ml/kg的剂量经口腔灌注10%水合氯醛进行催眠,诱导其处于仰卧位睡眠达4小时～6小时,连续8周。其余时间自由进食、进水、活动。3颏舌肌收缩力测定仰卧位睡眠8周后,应用1%戊巴比妥钠(20mg/kg-25mg/kg)对动物行全身麻醉,然后分离并暴露颏舌肌,将颏舌肌迅速制备成直径约为2mm的纵向肌条,并立即置于持续通入饱和氧(含95%02和5% CO2)、恒温37℃C的生理溶液浴槽(135mM氯化钠,2.5mM氯化钙,5mM氯化钾,15mM碳酸氢钠,1mM磷酸二氢钠,1mM硫酸镁,11mM葡萄糖)内,将肌条悬挂于张力换能器上,张力换能器与BL-420E+生物机能四通道实验系统相连。测量项目如下：①单收缩时的收缩力；②收缩时间；③半舒张时间；④各种刺激频率(1OHz、20Hz、40Hz、60Hz、80Hz、100Hz)时的肌张力。刺激电压：6V；刺激持续时间：300毫秒；相邻刺激间隔：2分钟,记录不同频率下的肌张力(单位：克)。肌肉休息10分钟后,进行颏舌肌疲劳试验,给予0.5Hz,持续5分钟连续的串刺激诱导颏舌肌疲劳,记录不同时间段(每间隔1分钟)单刺激下的肌张力(单位：克)。实验结束后,取出肌条,用滤纸吸干并称重。数据处理：肌张力要进行标准化,标准化方法：肌张力／肌条的横截面积肌条的横截面积=肌条的质量／最适初长度(Lmax)／肌密度(肌密度=1.06mg/mm3)在疲劳试验过程中,用百分比表示肌张力,即各个时间点测得的肌张力／基线肌张力(诱导疲劳前的肌张力)。将颏舌肌疲劳性与血氧饱和度进行相关性分析。4颏舌肌线粒体功能的测定颏舌肌细胞线粒体提取方法严格按照线粒体提取试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作步骤进行,将提取的线粒体制成悬液后以BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。同时应用线粒体膜电位检测试剂盒测定线粒体膜电位。装载JC-1荧光探针,流式细胞仪分析定量测定线粒体膜电位相对值,JC-1的单体(红色荧光)和聚合物(绿色荧光)荧光信号分别在FL1和FL2探测器上获得。经流式细胞仪检测后得出流式图,用Exp032ADC Analysis软件进行分析。比较红色荧光和绿色荧光的荧光强度来反映线粒体膜电位。激光共聚焦显微镜观察定性测定线粒体膜电位。在激光共聚焦显微镜下观察红色和绿色荧光。激发波长选择488nm和525nm,观察荧光信号,红色荧光强度减弱或出现绿色荧光即表明线粒体膜电位下降。5线粒体复合物Ⅰ活性测定严格按照线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性比色法定量检测试剂盒产品说明书进行。计算样品活性：样品总活性=[(样品读数—背景读数)×1(体系容量；毫升)×样品稀释倍数]÷[0.1(样品容量；毫升)×6.2(毫摩尔吸光系数)×1(反应时间,分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克单位=微摩尔NADH/分钟6线粒体复合物Ⅳ活性测定严格按照线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性比色法定量检测试剂盒产品说明书进行。计算样品活性：样品总活性=[(样品读数—背景读数)×1(体系容量；毫升)×样品稀释倍数]÷[0.1(样品容量；毫升)×21.84(毫摩尔吸光系数)×1(反应时间；分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克单位=微摩尔细胞色素C/分钟结果：1动物的一般状况各组动物建模后3天～5天能正常进食、饮水、活动自如。三组实验动物在建模前、建模2周后以及建模8周后的体重及进食量没有明显差异。所有动物均未发生意外,并顺利通过实验全程。2下颌前移矫治器治疗效果2.1上气道CT结果上气道CT显示：与对照组比较,OSAHS组的软腭后上气道横截面积以及上气道矢状向间隙明显减小(P<0.05),MAD组软腭后上气道横截面积以及上气道矢状向间隙比OSAHS组增大,MAD组和对照组间比较无明显差异(P>0.05)。2.2多导睡眠监测记录在多导睡眠监测记录期间,OSAHS组中所有动物均出现不同程度的呼吸暂停或低通气,即口鼻气流停止或通气降低/不足,同时伴有胸腹运动幅度增强,呼吸暂停低通气指数升高、动脉血氧饱和度降低以及睡眠效率明显降低；而MAD组呼吸暂停或低通气偶有发生,呼吸暂停低通气指数、动脉血氧饱和度和睡眠效率明显改善,近似于正常对照组(P>0.05)。3体外颏舌肌的收缩能力对照组、OSAHS组、MAD组颏舌肌的收缩张力分别为2.0±0.3g/cm2、 1.8±0.2g/cm2,1.9±0.2g/cm2;对照组、OSAHS组、MAD组颏舌肌的收缩时间为36.0±9.7ms,46.0±9.7ms,42.0±9.2ms;对照组、OSAHS组、MAD组颏舌肌的半舒张时间为为18.0±6.8ms,22.0±5.9ms,18.5±4.7ms,即OSAHS组颏舌肌的收缩张力减小,收缩时间和半舒张时间延长,但是三组间比较均无统计学差异(P>0.05)。对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌在相同频率下(10Hz、20Hz、 40Hz、60Hz、80Hz、100Hz)的张力(单位：g/cm2)比较均无统计学差异(P>0.05)。在疲劳试验中,与对照组相比,在每个时间点OSAHS组颏舌肌的疲劳性明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与OSAHS组比较,MAD组颏舌肌的疲劳性明显减小,差异具有统计学意义(P<0.05),MAD组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。4颏舌肌疲劳与血氧饱和度相关性分析在疲劳实验中,各时间点的肌张力与血氧饱和度均呈正相关,其中在第2分钟时相关性最大,r=0.773(P<0.001)。5颏舌肌线粒体的功能5.1颏舌肌线粒体膜电位流式细胞仪分析结果：对照组线粒体膜电位较高,红绿荧光的线粒体比例为10.94±3.19；OSAHS组颏舌肌线粒体膜电位明显下降,红绿荧光线粒体比例为0.02±0.00；MAD组颏舌肌红绿荧光的线粒体比例为).17±2.18,即与对照组比,OSAHS组颏舌肌线粒体膜电位明显下降(P<0.05),MAD组线粒体膜电位较OSAHS组升高(P<0.05), MAD组与对照组间无显著性差异(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察：正常对照组中线粒体膜电位较高,主要为红色荧光；OSAHS组中颏舌肌线粒体膜电位较低,以绿色荧光为主；MAD组中颏舌肌以红色荧光为主,绿色荧光少见。5.2颏舌肌线粒体呼吸链复合物活性与对照组相比,OSAHS组颏舌肌线粒体复合物Ⅰ活性、复合物Ⅳ活性明显下降(P<0.05),MAD组与OSAHS组比较,颏舌肌线粒体复合物Ⅰ活性、复合物Ⅳ活性升高,MAD组与对照组间比较无显著性差异(P>0.05)。第二部分下颌前移矫治器治疗OSAHS前后颏舌肌结构的改变目的：观察下颌前移矫治器治疗OSAHS前后颏舌肌超微结构及纤维分布的变化。方法：1实验动物、动物分组、动物模型的制备、及仰卧位睡眠方法同第一部分。2颏舌肌取材及病理切片的制备分离舌底部肌肉,暴露并小心离断颏舌肌,立即用10%福尔马林固定24小时,常规进行石蜡包埋。包埋后移入-200C冰箱过夜,然后行4um厚连续石蜡切片。3 HE染色所得石蜡切片行常规HE染色观察颏舌肌结构变化。4 Masson染色所得石蜡切片行常规Masson染色观察颏舌肌胶原纤维含量变化。5透射电镜暴露颏舌肌后,立即取Imm×1mm×3mm放入预冷的4%戊二醛中,常规透射电镜标本处理,透射电镜下,观察颏舌肌超微结构。6 ATP酶染色观察颏舌肌纤维分型连续冰冻切片后,常规方法进行酸性和碱性条件下的ATP酶染色,将所有切片于光学显微镜下观察,100倍物镜下计数300条相邻纤维,计算Ⅰ、Ⅱ型肌纤维的比例。7 SDS-PAGE电泳分析颏舌肌重链肌球蛋白亚型比例肌球蛋白提取后,采用BCA蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度。配制8%分离胶和5%浓缩胶灌入胶床,将肌球蛋白溶液加入上样缓冲液混匀,按每通道加入100μg蛋白上样。电泳条件：80V恒压,持续20小时,4℃C冰库中进行。电泳结束后,Marker 200KD附近取凝胶,用考马斯亮蓝R-250染色液染色30分钟,用考马斯亮蓝脱色液进行脱色。最后用Odyssey软件分析电泳条带光密度分布曲线下面积,其值表示重链肌球蛋白各亚型的相对含量。8 Real-Time PCR分析颏舌肌重链肌球蛋白Ⅰ型、重链肌球蛋白Ⅱa型、重链肌球蛋白Ⅱ b型、重链肌球蛋白Ⅱx亚型mRNA基因表达Trizol法提取组织总RNA,逆转录合成cDNA第一链,在Genebank中检索待测基因序列,用在线引物设计软件primer 3设计引物并检测其特异性,然后由生工生物工程(上海)有限公司合成引物。Real-Time PCR反应体系：上游引物(10μmol/L)0.6μl,下游引物10mol/L)0.6μl,cDNA 1.0μ1,去离子水(无RNA酶)7.8μl,总体系为20μl。反应结束后,由ABI 7500 v2.0.1软件自动分析荧光信号,并将其转换为重链肌球蛋白及β-actin的CT值。采用AACT相对定量法计算基因表达量,即平均相对量=2-平均ΔΔCT,即为实验组样本基因表达量相对于对照组样本基因表达量的变化倍数。9统计学分析所有数据均采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理,统计描述用均数土标准差(Mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,检验水准为α=0.05。结果：1颏舌肌的形态学观察1.1 HE染色正常对照组：颏舌肌肌纤维排列整齐。OSAHS组：颏舌肌肌纤维可见不同程度的变性,表现为肌纤维排列紊乱,溶解变性,肌纤维正常结构消失、凝集。MAD组颏舌肌肌纤维排列比较整齐,肌纤维紊乱及变性程变较轻,接近于正常对照组。1.2 Masson染色Masson染色结果显示肌纤维呈红色,胶原纤维呈绿色,红细胞为橙色。对照组：肌纤维排列整齐,细胞周围可见少量胶原结缔组织包绕,胶原纤维分布比较均匀,纤细。OSAHS组：颏舌肌肌纤维排列紊乱,胶原组织明显增多,排列不规则,分布不均。MAD组颏舌肌肌纤维排列比较整齐,胶原结缔组织(绿色物)明显减少,接近于正常对照组的颏舌肌。.3颏舌肌超微结构对照组：肌原纤维结构规整,明带及暗带清楚,H带内M线清晰,明带内Z线明显,肌丝排列规则、整齐。线粒体形状规则,为圆形或椭圆形,内外膜完整、嵴丰富,结构完整且清晰。OSAHS组：颏舌肌肌原纤维排列紊乱,肌纤维间的线粒体均有不同程度的肿胀变性,大小不一、形状不规则,部分线粒体嵴断裂、溶解,部分线粒体嵴、膜融合,甚至消失。MAD组：肌纤维及线粒体变性程度减轻,肌原纤维排列轻度紊乱,线粒体轻度变性、水肿,线粒体嵴、膜融合偶见,接近于正常对照组。2颏舌肌纤维分型结果2.1 ATP酶染色结果OSAHS组颏舌肌Ⅱ型纤维比例较对照组和MAD组明显增高；Ⅰ型纤维比例较对照组和MAD组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)；MAD组颏舌肌纤维比例与对照组比较,无统计学差异(P>0.05)2.2 SDS-PAGE结果与对照组相比,OSAHS组颏舌肌重链肌球蛋白Ⅰ亚型比例降低,重链肌球蛋白Ⅱa+Ⅱx亚型比例降低,而重链肌球蛋白Ⅱb亚型比例明显增加(P<0.05)。与OSAHS组相比,MAD组颏舌肌重链肌球蛋白Ⅰ亚型、重链肌球蛋白Ⅱa+Ⅱx亚型比例均升高,重链肌球蛋白Ⅱb亚型比例降低,异均有统计学意义(P<0.05)。MAD组颏舌肌重链肌球蛋白亚型比例与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。2.3 Real-time PCR结果与对照组和MAD组相比,OSAHS组颏舌肌重链肌球蛋白Ⅰ亚型、重链肌球蛋白Ⅱa亚型mRNA表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)；重链肌球蛋白Ⅱb亚型、重链肌球蛋白Ⅱx亚型mRNA表达量升高,具有统计学意义(P<0.05)。MAD组与对照组间的各个重链肌球蛋白业型的nRNA表达量无明显差异(P>0.05)。第三部分OSAHS致颏舌肌功能结构改变的机制探讨目的：应用前期的实验方法建立OSAHS动物模型,从氧化应激角度入手,探讨氧化应激途径是否为OSAHS导致颏舌肌结构和功能紊乱的机制。方法：1实验动物、实验分组、建模方法、MAD制作、佩戴及仰卧位睡眠司本课题的第一部分。2用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血浆中及颏舌肌组织中8-异前列腺素的含量。取血：全麻下取兔耳缘静脉血1.5ml,4000rpm/s,离心5min,取上清,-70℃保存备用。应用兔8-异前列腺素酶联免疫分析(ELISA)试剂盒进行测定。3丙二醛含量测定：应用TBA法测定颏舌肌组织中丙二醛含量。4谷胱甘肽含量测定：应用谷胱甘肽测定试剂盒测定颏舌肌组织中谷胱甘肽含量。5超氧化物歧化酶活性测定：应用超氧化物歧化酶分型测定试剂盒测颏舌肌组织中总超氧化物歧化酶活性、铜-锌超氧化物歧化酶活性、并计算出锰-超氧化物歧化酶活性。6过氧化氢酶活性测定：可见光法过氧化氢酶测定试剂盒测定颏舌肌组织中过氧化氢酶含量。7琥珀酸脱氢酶活性测定：应用琥珀酸脱氢酶测定试剂盒测定颏舌肌组织中琥珀酸脱氢酶活性。结果：1氧化应激水平对照组血浆内及颏舌肌组织内8-异前列腺素含量：534.9±62.7pg/m1528.1±28.2pg/ml,OSAHS组兔血浆内及颏舌肌组织内8-异前列腺素含量分别为:1018.9±95.2pg/ml和790.2±69.4pg/ml,与对照组相比,OSAHS组8-异前列腺素含量明显升高(P<0.05)。相关分析结果表明颏舌肌组织为和血浆内8-异前列腺素含量呈明显正相关,r=0.678。MAD组血浆内及579.8±61.7pg/ml,I明显低于OSAHS组8-异前列腺素含量(P<0.05)。MAD组与对照组间无统计学差异(P>0.05)。对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌内丙二醛含量分别为：5.11±1.07nmol/mgprot、6.24±0.66nmol/mgprot和4.45±1.22nmol/mgprot。与对照组相比,OSAHS组颏舌肌组织内丙二醛含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。MAD组颏舌肌组织内丙二醛含量明显低于OSAHS组差异具有统计学意义(P<0.05)。MAD组与对照组相比,无统计学差异(P>0.05)。2抗氧化能力对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织内总超氧化物歧化酶活性分别为：3.91±1.15 U/mgprot,2.08±0.44U/mgprot和3.28±0.45 U/mgprot;对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织内铜-锌超氧化物歧化酶活性分弓为：3.16±0.91 U/mgprot,1.87±0.43 U/mgprot和2.61±0.50 U/mgprot;对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织内锰-超氧化物歧化酶活性分别为：0.76±0.41 U/mgprot,0.21±0.14 U/mgprot和0.68±0.37 U/mgprot。即与对照组和MAD组相比,OSAHS组颏舌肌组织内总超氧化物歧化酶活性、铜-锌超氧化物歧化酶活性、锰-超氧化物歧化酶活性均降低,具有统计学意义(P<0.05)；而MAD组与对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)。对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织谷胱甘肽含量分别为：9.05±2.78mgGSH/gprot,4.19±0.79mgGSH/gprot和8.15±2.23mgGSH/gprot。对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织内过氧化氢酶活性分别为：19.15±4.92 U/mgprot,12.76±4.55 U/mgprot和17.63±5.11 U/mgprot。对照组、OSAHS组和MAD组颏舌肌组织内琥珀酸脱氢酶活性分别为：29.58±8.22 U/mgprot.19.50±6.80 U/mgprot和30.61±7.12 U/mgprot。即与对照组相比,OSAHS组颏舌肌组织内谷胱甘肽含量、过氧化氢酶活性和琥珀酸脱氢酶活性均明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。而MAD组颏舌肌组织内谷胱甘肽含量、过氧化氢酶活性和琥珀酸脱氢酶活性较OSAHS组升高,与对照组间无明显差异(P>0.05)。结论：1 OSAHS可导致颏舌肌疲劳性增加,线粒体功能降低,引起其结构紊乱及纤维分布异常,氧化应激途径为OSAHS改颏舌肌病变的机制之一。2下颌前移矫治器可逆转OSAHS寸颏舌肌功能结构的损害,发挥对颏舌肌的保护作用。