随着人口老龄化进程的加快,缺氧缺血性脑病的发生率也逐年升高,其居高不下的致死率及致残率给患者、家庭和社会造成严重的心理和经济负担。如何防治这一类疾病成为当前医学研究的重点之一。再者临床中相当多的事件如脑血管狭窄或阻塞合并低血压、休克或心肺功能衰竭均会导致缺氧缺血。而脑组织对缺氧缺血尤为敏感,因此在这些事件中脑是最容易受损伤的部位。近年的研究也表明,缺氧性脑病、脑缺血、脑外伤、神经系统退行性变等神经系统疾病均存在细胞的坏死和凋亡,因此神经保护仍是当前神经科学研究领域的一个重大课题。　　 硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)长期以来被认为是一种无色,高度水溶性并带有臭鸡蛋气味的有毒气体。而近年的研究却发现H2S不仅是一种新颖的神经调质,参与调制中枢神经系统的生理及病理功能；而且也是一种重要的细胞保护成分,可以通过诱导机体进入低代谢状态,减少机体的氧需要量,大大延长动物在低氧环境中的生存时间,而无不良反应；H2S也可通过其抗氧化应激和抗细胞凋亡作用对抗缺氧-缺血诱导的细胞凋亡,提示H2S在抗缺氧损伤中发挥着重要的保护作用。　　 随着对H2S保护作用机制研究的不断深入,证实H2S具有细胞保护作用的普遍性,且多条信号通路参与了H2S的细胞保护作用。那么H2S是否能保护神经细胞对抗化学性缺氧诱导的细胞凋亡,以及H2S的神经保护作用机制何在?本课题将对以上问题展开以下的研究工作。　　 第一部分硫化氢对抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用　　 目的:　　 探讨H2S是否可以保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤　　 方法:　　 1.细胞损伤程度的判断:CCK-8法测定PC12细胞的存活率。　　 2.细胞凋亡的判断:Hoechst33258染色检测细胞形态学改变,流式细胞术检测DNA含量的变化。　　 3.细胞内ROS检测:DCFH-DA染色,荧光显微镜观察胞内DCF绿色荧光强度,ImageJ1.41°图片分析软件中的Color Histogram模块计算出各视野绿色荧光强度的平均值。　　 4.MMP的检测:Rh123染色,荧光显微镜观察胞内Rh123绿色荧光强度,ImageJ1.41°图片分析软件中的Color Histogram模块计算出各视野绿色荧光强度的平均值。　　 5.用SPSS13.0 for Windows统计软件进行数据分析。数据用均数±标准差((X)±S)表示,用单因素方差分析(One-way ANOVA)的LSD进行组间比较,检验水准α=0.05。　　 结果:　　 1.化学性低氧模拟剂CoCl2对PC12细胞具有明显的细胞毒性作用CCK-8法检测结果显示,随CoCl2干预浓度和时间的增加,可引起细胞存活率显著降低,且呈明显的浓度-时间依赖关系。　　 2.NaHS预处理保护PC12细胞对抗CoCl2诱导的细胞毒性作用 CCK-8法检测结果显示,25～400μmol/L浓度范围内,NaHS呈浓度依赖性地抑制CoCl2诱导的细胞毒性,其中400μmol/L的NaHS保护作用最显著(本身不影响PC12细胞的存活率),但随NaHS浓度的加大,保护效应下降；NaHS预处理15min开始发挥保护作用,到30min达高峰,保护效应可一直持续到180min。普通光学显微镜观察结果显示,600μmol/L CoCl2干预PC12细胞使细胞突起明显减少,细胞之间的连接基本消失；而当400μmol/L NaHS预处理30min之后,细胞突起明显增多,细胞间的连接增加。　　 3.NaHS预处理保护PC12细胞对抗CoCl2诱导的细胞凋亡Hoechst33258染色结果显示,NaHS预处理可明显减少CoCl2诱导的凋亡细胞数量；流式细胞仪检测结果表明,NaHS预处理PC12细胞可使CoCl2引起的细胞凋亡率显著下降。　　 4.NaHS预处理抑制CoCl2引起的细胞内ROS生成增多荧光显微镜检测细胞内DCF的荧光强度显示,CoCl2干预PC12细胞3h之后引起胞内ROS生成增多,NaHS本身不影响ROS生成,但当其预处理30min之后胞内的DCF荧光强度显著减弱。　　 5.NaHS预处理抑制CoCl2引起的MMP降低荧光显微镜检测细胞内Rh123荧光强度显示,CoCl2作用PC12细胞24h后MMP明显降低,当NaHS预处理PC12细胞30min之后能显著地抑制CoCl2引起的MMP降低。　　 结论:　　 1.CoCl2具有明显的细胞毒性,并通过增加PC12细胞内ROS水平降低MMP诱导细胞凋亡。　　 2.H2S具有保护PC12细胞对抗CoCl2诱导凋亡的作用,此作用可能与其抑制ROS生成增多和改善MMP有关。　　 第二部分 P13K/Akt信号通路在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧中的作用　　 目的:　　 探讨P13K/Akt信号通路是否参与H2S预处理对抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用　　 方法:　　 1.Western-blot分析相关蛋白质表达水平的变化。　　 2.余同上。　　 结果:　　 1.NaHS预处理以P13K依赖的方式诱导p-Akt的表达Western-blot结果显示,在50～400μmol/L浓度范围内,NaHS呈浓度依赖性地促进p-Akt的表达,尤以400μmol/L NaHS干预时表达最高,但随着NaHS干预浓度的继续增加则呈下降趋势；NaHS预处理0～60min时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞p-Akt的表达,30min p-Akt表达达高峰,随着干预时间的继续延长,p-Akt表达逐渐下降；P13K抑制剂Ly294002拮抗了NaHS预处理引起的p-Akt表达。　　 2.P13K/Akt介导NaHS预处理抗CoCl2损伤的细胞保护作用　　 ⅰ P13K抑制剂Ly294002拮抗NaHS顸处理减轻细胞损伤的作用CCK-8法检测结果显示,NaHS预处理可以使PC12细胞对抗CoCl2引起的细胞存活率下降,而在预处理前使用Ly294002,细胞的存活率明显降低。　　 ⅱ P13K抑制剂Ly294002拮抗NaHS预处理的抗细胞凋亡作用 Hoechst33258染色结果显示,NaHS预处理明显减少凋亡细胞的数量。但在预处理前使用Ly294002则可使凋亡细胞的数量增加。流式细胞仪检测结果表明,NaHS预处理PC12细胞可使CoCl2引起的细胞凋亡率显著下降,而预处理前使用Ly294002明显增加细胞的凋亡率。　　 ⅲ P13K抑制剂Ly294002拮抗NaHS预处理对ROS生成的抑制作用荧光显微镜检测细胞内DCF的荧光强度显示,NaHS预处理明显减少CoCl2引起的ROS生成增加,而预处理前使用Ly294002明显抑制NaHS预处理对ROS生成的拮抗作用。　　 ⅳ P13K抑制剂Ly294002抑制NaHS预处理对MMP的提高作用荧光显微镜检测细胞内Rh123的荧光强度显示,NaHs预处理明显抑制CoCl2引起的MMP降低,而预处理前使用Ly294002明显拮抗NaHS预处理对MMP的稳定作用。　　 结论:　　 1.H2S预处理通过P13K依赖途径引起Akt的活化。　　 2.P13K/Akt信号通路的激活参与了H2S预处理抗化学性缺氧的细胞保护作用。　　 3.P13K/Akt信号通路的抗细胞凋亡作用涉及ROS/MMP依赖途径。　　 第三部分 PI3K/Akt信号通路在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧中的调控机制　　 目的:分别探讨Hsp90、survivin和GRP78在H2S预处理对抗化学性缺氧PC12细胞保护中的作用；阐明PI3K/Akt信号通路对Hsp90、survivin和GRP78的调控作用。　　 方法: 同第二部分。　　 结果:　　 一、PI3K/Akt-Hsp90信号通路介导硫化氢抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用　　 1.CoCl2促进Hsp90的表达 Western-blot结果显示,24h之前单纯CoCl2并未能促进Hsp90表达；但之后Hsp90表达增加,到48h其表达达高峰,随CoCl2作用时间的延长,Hsp90表达又开始下降,到72h Hsp90表达甚至低于正常对照。　　 2.单纯NaHS干预PC12细胞上调Hsp90的表达 Western-blot结果显示,400μmol/L NaHS作用PC12细胞不同时间0～180min时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞Hsp90的表达,180min Hsp90表达达高峰,随着干预时间的继续延长,Hsp90表达逐渐下降,24h基本恢复到正常水平。　　 3.Hsp90介导NaHS预处理抗CoCl2损伤的细胞保护作用　　 ⅰ.Hsp90抑制剂17-AAG拮抗NaHS预处理减轻细胞损伤的作用 CCK-8法检测结果显示,NaHS预处理可以使PC12细胞对抗CoCl2引起的细胞存活率下降,而在预处理前使用17-AAG,细胞的存活率明显降低。　　 ⅱ Hsp90抑制剂17-AAG拮抗NaHS预处理的抗细胞凋亡作用 Hoechst33258染色结果显示,NaHS预处理明显减少凋亡细胞的数量。但在预处理前使用17-AAG则可使凋亡细胞的数量增加。流式细胞仪检测结果表明,NaHS预处理PC12细胞可使CoCl2引起的细胞凋亡率显著下降,而预处理前使用17-AAG明显增加细胞的凋亡率。　　 ⅲ.Hsp90抑制剂17-AAG拮抗NaHS预处理对ROS生成的抑制作用荧光显微镜检测细胞内DCF的荧光强度显示,NaHS预处理明显减少CoCl2引起的ROS生成增加,而预处理前使用17-AAG明显抑制NaHS预处理对ROS生成的拮抗作用。　　 ⅳ.Hsp90抑制剂17-AAG抑制NaHS预处理对MMP的提高作用荧光显微镜检测细胞内Rh123的荧光强度显示,NaHS预处理明显抑制CoCl2引起的MMP降低,而预处理前使用17-AAG明显拮抗NaHS预处理对MMP的稳定作用。　　 4.NaHS预处理上调Hsp90的表达 Western-blot结果显示,损伤前给予NaHS预处理可进一步上调CoCl2诱导的Hsp90高表达,17-AAG则可以抑制NaHS预处理对Hsp90表达的上调作用。　　 5.NaHS预处理通过PI3K/Akt途径诱导了Hsp90的表达 Western-blot结果显示,PI3K抑制剂Ly294002抑制了NaHS预处理诱导的Hsp90表达上调。以上结果充分证实,Hsp90参与了H2S预处理抗化学性缺氧的细胞保护作用,且是PI3K/Akt途径依赖性的。　　 二、PI3K/Akt和Hsp90信号通路对硫化氢诱导survivin表达抗化学性缺氧的调控作用　　 1.CoCl2促进survivin的表达 Western-blot结果显示,正常PC12细胞基本不表达或低表达survivin;当应用不同浓度CoCl2处理PC12细胞24h后,在200～600μmol/L浓度范围内,呈浓度依赖性地促进survivin表达,尤以600μmol/L CoCl2干预时表达最高,但随着CoCl2干预浓度的继续增加则呈下降趋势,当浓度增加到1000μmol/L时基本不能诱导survivin的表达；600μmol/L CoCl2干预PC12细胞0～36h时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞survivin的表达,36hsurvivin表达达高峰,但随着干预时间的继续延长(48h),survivin表达明显下降。　　 2.单纯NaHS上调survivin的表达 Western-blot结果显示,当应用不同浓度NaHS处理PC12细胞30min后,在50～200μmol/L浓度范围内,呈浓度依赖性地促进survivin表达,尤以200μmol/L NaHS干预时表达最高,但随着NaHS干预浓度的继续增加则呈下降趋势,当高浓度800μmol/L NaHS处理时survivin的表达甚至低于正常对照；400μmol/L NaHS干预PC12细胞,0～60min时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞survivin的表达,60min survivin表达达高峰,但随着干预时间的继续延长,survivin表达逐渐下降。　　 3.NaHS预处理上调survivin的表达 Western-blot结果显示,预处理条件下NaHS进一步促进了CoCl2引起的survivin高表达。　　 4.PI3K/Akt信号通路介导NaHS预处理上调survivin的表达 Western—blot结果显示,PI3K抑制剂Ly294002抑制了NaHS预处理诱导的survivin表达上调。　　 5.Hsp90信号通路介导NaHS预处理上调survivin的表达 Western-blot结果显示,Hsp90抑制剂17-AAG抑制了NaHS预处理诱导的survivin表达上调。　　 结果表明,H2S预处理可以激活survivin,PI3K/Akt和Hsp90信号通路可通过survivin介导H2S预处理的细胞保护作用。　　 三、PI3K/Akt-GRP78信号通路介导硫化氢抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用　　 1.CoCl2诱导GRP78表达 Western-blot的检测结果显示,随CoCl2干预浓度的增加GRP78表达逐渐增加,尤以800μmol/L CoCl2干预时表达最高,但随着CoCl2干预浓度的继续增加则呈下降趋势；600μmol/L CoCl2干预PC12细胞,0～24h范围内,呈时间依赖性地促进GRP78的表达,24h时GRP78表达达高峰,但随着干预时间的继续延长,GRP78表达明显下降。　　 2.单纯NaHS不影响GRP78的表达 Western-blot的检测结果显示,不同浓度NaHS处理PC12细胞30min后,并未影响PC12细胞内GRP78的表达。　　 3.NaHS预处理下调CoCl2诱导的GRP78高表达 Western-blot的检测结果显示,预处理条件下NaHS可以降低CoCl2引起的GRP78高表达。　　 4.PI3K/Akt信号通路介导NaHS预处理对GRP78的抑制作用 Western—blot结果显示,PI3K抑制剂Ly294002减弱了NaHS预处理对GRP78的抑制作用。　　 结论:　　 1.CoCl2诱导的Hsp90和survivin高表达可能是细胞的自我保护机制之一。　　 2.Hsp90和survivin信号通路介导了H2S预处理抗化学缺氧的PC12细胞保护作用。　　 3.Hsp90信号通路的抗细胞凋亡作用涉及ROS/MMP依赖途径。　　 4.PI3K/Akt信号通路通过Hsp90介导H2S预处理的抗化学性缺氧细胞保护作用。　　 5.survivin作为PI3K/Akt和Hsp90信号通路激活后的共同效应蛋白,可能是PI3K/Akt和Hsp90介导H2S预处理的细胞保护作用的共同机制之一。　　 6.CoCl2诱导的PC12细胞凋亡可能存在着ERS介导的凋亡途径。　　 7.H2S预处理可通过下调GRP78的表达发挥抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用,而其本身并不诱导ERS。　　 8.PI3K/Akt信号通路通过GRP78介导H2S预处理的细胞保护作用。　　 总结:　　 综合本研究各部分的实验结果表明:H2S预处理激发了细胞内在的自我保护机制,从而使细胞能够对抗化学性缺氧引起的损伤和凋亡。这种保护作用是由于H2S预处理启动了细胞内某些具有抗凋亡作用的信号转导途径如PI3K/Akt。H2S通过PI3K依赖的方式激活Akt激酶,激活后的Akt可以促进某些应激基因的快速表达,合成对细胞具有保护作用的应激蛋白质Hsp90和survivin,同时通过减少ROS的生成、增强线粒体膜的稳定性,抑制线粒体途径和ERS途径诱导的凋亡以发挥对抗化学性缺氧的PC12细胞保护作用(总结如下图)。