论文部分内容阅读
研究背景:化学药物治疗（简称化疗）因其可以有效杀死癌细胞,成为临床癌症治疗中最主要的手段之一。然而,由于不同癌症间的异质性以及癌症患者个体的差异性,仅有部分患者能产生较好的应答,并且患者需要忍受许多严重或是长期的毒副作用。药物递送系统以其可增强药物的水溶性、延长其体内半衰期、实现药物的肿瘤蓄积进而提高药物的安全性。此外,载药系统可实现肿瘤微环境的高还原性、低pH响应性释放药物等优点,被认为是近年抗肿瘤领域研究的热点和突破点。卡巴他赛（Cabazitaxel,CTX）作为新型的半合成紫杉烷类广谱抗肿瘤药物,由于与药物外排转运泵P-糖蛋白（P-gp）的亲和力低,可用于克服紫杉醇及多烯紫杉醇的耐药。但由于卡巴他赛水溶性差并伴有严重的系统毒性,在实际临床实践中受到了限制。基于此,本研究着力于开发一种新型的CTX智能纳米药物递送系统,以期有效降低CTX系统毒性,提高CTX的临床应用价值,为克服紫杉烷类药物的耐药,提高治疗效果,提供新的药物设计思路。研究目的:本研究以聚乙二醇作为亲水部分,利用还原响应性的二硫键控制药物的释放,将CTX化学修饰后,通过自由基聚合制备CTX聚合物水凝胶,从而提高CTX的水溶性、延长其在血液中的循环时间、提高药物选择性、降低药物的系统毒性,为克服紫杉醇耐药和CTX的临床使用提供新的解决方案。研究方法:1.CTX、PEG2000-NH2以及双-（2-羟乙基）-二硫化合物各自通过化学反应后连接上碳碳双键,以偶氮二异丁腈作为引发剂,通过自由基聚合制备CTX聚合物水凝胶,并采用核磁共振氢谱和傅里叶变换红外光谱对其进行表征。2.在水中制备得到CTX纳米水凝胶药物（CTX nanogels）,利用动态光衍射法与透射电镜对其粒径及形貌进行表征,通过体外实验,研究其稳定性以及还原响应释放性能。3.通过CCK-8法以及Calcein-AM/PI活/死双染实验测定CTX nanogels对肿瘤细胞的杀伤能力,利用共聚焦显微镜和流式分析仪研究其的入胞方式及入胞能力。通过EDU增殖实验和AO/EB凋亡实验,研究CTX nanogels抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡的能力。最后通过微管聚集实验,研究CTX nanogels产生药效的作用方式。4.通过活体成像实验,研究CTX nanogels的体内分布以及肿瘤蓄积情况。通过溶血实验研究CTX nanogels的血液相容性。通过ICR小鼠的尾静脉注射药物,评价研究CTX nanogels的体内安全性。通过人宫颈癌耐紫杉醇细胞HeLa/R的皮下瘤模型,研究CTX nanogels的体内抗肿瘤能力。5.疏水性的PI3K和蛋白激酶mTOR抑制剂PI-103,采用与CTX nanogels相同的制备方法制备PI-103 nanogels,研究此载药系统的普适性。研究结果:1.成功合成出CTX聚合物水凝胶并制备得到均一稳定的CTX nanogels,其水合粒径在150 nm左右,并在含20%胎牛血清的磷酸缓冲液中可以稳定存放超过两周,且粒径不存在显著改变,说明所制备CTX nanogels具有优异的稳定性。并且CTX nanogels能够在模拟肿瘤细胞高还原性环境下,快速地释放药物。2.CCK-8和Calcein-AM/PI活/死双染结果显示,CTX nanogels具有有效的体外肿瘤杀伤能力,虽略低于游离型CTX,但通过对耐药系数的计算证明其有望克服紫杉醇耐药。内吞实验和微管聚集实验结果显示,CTX nanogels能以内吞的方式快速进入肿瘤细胞,在胞内释放出CTX,与微管蛋白结合抑制微管的解聚过程,实现对肿瘤细胞的杀伤作用。EDU和AO/EB实验则观察到CTX nanogels具有显著抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡的能力。3.活体成像实验表明CTX nanogels能够在体内保持长循环的同时,在肿瘤部位实现蓄积,其离体肿瘤荧光强度是小分子组的5.3倍。在溶血实验中,CTX nanogels在给药剂量为50mg/Kg（CTX eqv.）时也不会导致明显的溶血,具有良好的血液相容性。ICR小鼠的安全性评价中,CTX nanogels在高剂量条件下,也不会引起小鼠明显的体重变化、白细胞数目下降以及肝肾毒性,展现出优异的安全性。4.人宫颈癌耐紫杉醇细胞HeLa/R的皮下瘤模型中,低剂量的CTX nanogels与同等剂量的游离型CTX在药效上没有显著性差异,而高剂量的CTX nanogels展现了优于游离型CTX治疗组的抗肿瘤能力,且规避了游离型CTX组小鼠出现明显的体重下降（～15%）的风险。表明CTX nanogels具有不输于游离药物的肿瘤药效,且显著提高药物的耐受剂量,并保证了药物使用中的安全性。5.成功制备PI-103 nanogels,并且体外研究证实其具有同样优异的稳定性,可以在肿瘤细胞中发挥有效杀伤作用。研究结论:本研究通过具有聚合性前药的设计,制备了具有还原响应性的CTX nanogels,解决了 CTX水溶性差,系统毒性大等缺点,可在体内实现长循环、肿瘤蓄积、瘤内响应释放,并能够克服紫杉烷类药物的耐药性。此外,该聚合物水凝胶药物递送系统可适用于其他疏水性药物的智能递送,为肿瘤的治疗提供新的研究思路。