早期高血压大鼠血清血浆五羟色胺含量测定及大鼠尿液中内源性糖类的测定方法研究

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近二十年来,广谱代谢组学在疾病研究中得到了快速广泛的发展和应用。因而内源性代谢物的准确定量方法研究及在疾病研究中基于某种或某些种内源性代谢物研究,得到了巨大的发展推动力。本论文基于亲水液相色谱-串联质谱联用技术,对两类内源性代谢物进行了研究。本论文包括,1)大鼠血清或血浆中内源性五羟色胺(5-hydroxy-tryptamine,5-HT)的方法研究;2)早期高血压大鼠血清或血浆中5-HT的定量测定,以及内源性5-HT的变化与高血压发生发展的关系;3)大鼠尿液中内源性糖类的方法学研究。5-HT是单胺类神经递质(monoamine neurotransmitters,MNTs)的一种,目前已证实有多种疾病与五羟色胺在体内的浓度变化有密切关联。在高血压疾病中,早期研究发现,高血压病人或高血压模型动物的血浆5-HT升高,似乎表明5-HT具有血管收缩的升高血压的作用,但近期研究又发现,5-HT的生物学作用有双相性,既具有血管扩张作用又具有血管收缩作用。我们在本课题组前期建立的5-HT定量测定方法基础上,重新选择了结构类似的内标准品,改进了大鼠血清或血浆中5-HT定量测定的新方法,并进行了方法验证。本方法基于亲水液相色谱-串联质谱联用技术,具有简单快速准确的优点。结果显示,以5倍体积的预先冷却有机溶剂(甲醇/乙腈,体积比50/50)进行蛋白沉淀,涡旋1 min至混匀,-20℃下冷冻静置20 min,13000 r/min 4℃离心15 min,为最优萃取条件。线性、精确度、回收率、基质效应、稳定性和保留时间重现性的结果,显示此方法符合定量测定大鼠血清或血浆中内源性5-HT的要求。该定量方法在灵敏度、高通量和样品制备简单化上表现出色。我们采用大鼠血清血浆中5-HT定量测定的新方法,对早期高血压大鼠和正常大鼠血清和血浆中的五羟色胺进行了定量检测分析,旨在确定内源性5-HT与高血压发生发展的关系。我们的结果显示,在早期高血压大鼠血清中的五羟色胺含量,相比正常大鼠,表现出显著的下降变化趋势,具有显著性差异,说明高血压大鼠血清中的五羟色胺,在高血压的疾病病理及疾病发展机制中,有可能具有指示作用,值得进一步的研究。同时,不同于前期针对高血压中后期病理状态研究中发现的血浆游离5-HT升高的结果,早期高血压大鼠血浆中的游离5-HT含量,相比正常大鼠,不具有显著性差异。说明在早期高血压大鼠阶段,尚未出现游离5-HT升高的状况,这也意味着游离5-HT的升高不是高血压形成的因。我们的结果与近期文献5-HT血管扩张效果的结果相呼应,进一步证明了,高血压产生的主导因素不在于外围血液循环系统中升高的5-HT;另一方面,在11周龄的高血压大鼠中,相比同周龄的正常大鼠,高血压大鼠血清中五羟色胺含量显著降低,说明了五羟色胺有可能对高血压有深层次的病理影响。糖类主要包括单糖、双糖和多糖。在最近的研究中,糖类因其生物活性和生理功能,在有关癌症和多种疾病的代谢组学研究中,受到了更多关注,甚至被作为潜在的生物标志物进行了深入研究。为了研究大鼠的内源性糖代谢,我们旨在开发一种简单、快速、并可以同时检测大鼠尿液中的多种内源性糖类的定量测定方法。针对同时定量测定大鼠尿中15种内源性糖类化合物,我们对包括色谱柱、色谱条件、质谱条件、尿样制备方法等不同的条件进行了分析和优化。并对此方法的精确度、灵敏度、线性、保留时间重现性和回收率进行了方法验证。结果显示,以5倍体积的预先冷却有机溶剂(甲醇/乙腈,体积比50/50)进行蛋白沉淀,震荡1分钟并且在-20?C环境孵育20分钟为最优萃取条件。线性、精确度、回收率、基质效应、稳定性和保留时间重现性的结果,显示此方法符合定量测定大鼠尿中内源性糖类的要求。该定量方法满足了代谢组学后续定量研究的需求,该方法定量测定了大鼠尿液中的内源性糖类,在灵敏度、高通量和样品制备简单化上表现出色。
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