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原发性肝细胞型肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,位居全世界恶性肿瘤发病率的第6位,在我国已成为恶性肿瘤的第2位死因。手术切除仍是目前治疗HCC最有效的方法,但因早期诊断率低和术后复发率高,限制了肝癌的治疗效果。加深对HCC细胞生物学特性的了解,探寻HCC发生发展的内在机制,寻求有效的早期诊断和治疗方法,对于提高HCC的疗效,改善HCC患者预后具有积极意义。侵袭、转移是恶性肿瘤的重要生物学特征。HCC是血供丰富的实体肿瘤。新生血管的生成与HCC的生长、侵袭和转移密切相关,二甲基 精 氨 酸-二 甲 胺 水 解 酶2(dimethylarginine-dimethylaminohydrolase2,DDAH2)在血管新生的调节中起到重要作用。DDAH2通过DDAH/ADMA/NO途径调控内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的生成从而参与血管的生成。DDAH2在肺癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤细胞及组织中均高表达,其表达水平与肿瘤的浸润和转移能力密切相关。相比于其他肿瘤中的研究,目前对肝癌发生发展中DDAH2的作用仍知之甚少。因此,本研究结合临床资料分析、慢病毒干扰沉默基因等多种实验方法,从人群、分子、细胞水平观察DDAH2基因在肝癌中的作用,探讨其机制为HCC的诊断和治疗提供新的靶点和思路。本研究纲要:第一章 观察DDAH2基因在人肝癌组织和癌旁肝组织中的表达差异,探讨其表达水平和肿瘤分化程度、侵袭及转移能力之间的关系;第二章 构建慢病毒载体靶向干扰沉默DDAH2基因的表达,检测干扰效果,备下一步功能实验;第三章 使用靶向干扰DDAH2基因表达的慢病毒载体作用于肝癌细胞后,观察肝癌细胞增殖、迁移的改变,以及VEGF表达的变化。第一章 DDAH2蛋白在人肝癌组织及细胞系中的表达及临床意义目的:研究DDAH2基因在人HCC组织和相应癌旁肝组织中的表达特点,分析DDAH2基因表达与肿瘤分化程度、侵袭及转移能力之间的关系,并观察DDAH2基因在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达情况。方法:利用免疫组化检测40例HCC组织和相应癌旁肝组织中DDAH2表达情况,收集HCC患者临床资料,分析DDAH2基因表达与HCC患者临床病理因素的相关性,进一步在体外使用人肝癌细胞SMMC-7721行细胞免疫组化,以证实组织学结果。结果:HCC组织中DDAH2蛋白表达明显高于癌旁肝组织(p<0.001)。肝癌DDAH2阳性率与肝癌组织中CD31、CD34阳性表达密切相关(p=0.008),与其他病理因素:性别、年龄、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级无显著性差异。DDAH2基因在SMMC-7721细胞中高表达。结论:1)DDAH2基因在HCC组织中高表达,并与HCC病理组织中CD31、CD34提示的肿瘤血管增生正相关。2)DDAH2在HCC细胞SMMC-7721中高表达,能用于后续实验。第二章 DDAH2基因RNA干扰慢病毒载体制备、包装及病毒滴度测定目的:构建DDAH2基因稳定干扰的SMMC-7721细胞系。方法:设计针对DDAH2基因的慢病毒RNAi载体,并感染SMMC-7721细胞,采用Real-time PCR和Western blot技术分别检测DDAH2 mRNA和蛋白表达水平,并与阴性对照组和空白对照组SMMC-7721细胞比较。结果:以DDAH2 mRNA序列为靶点进行干扰片段设计,成功构建三对针对DDAH2基因不同位点的特异性RNAi序列,转染HCC细胞SMMC-7721后荧光显微镜观察转染效率均在80%以上,qPCR结果示:pGMLV-DDAH2 RNAi-1,2,3 DDAH2 mRNA相对表达量分别为阴性对照组的 32.1%,65.6%,48.3%。Western blot 结果示,pGMLV-DDAH2 RNAi-1,2,3 DDAH2蛋白相对表达水平与阴性对照组相比明显下降,其中,DDAH2 RNAi-1靶点效果最好(p<0.05)。综合qPCR和Western blot结果,3组干扰片段中,DDAH2 RNAi-1靶点干扰效果最高,用此靶点进行后续实验。结论:成功筛选出高效抑制DDAH2基因表达的慢病毒载体,成功转染HCC细胞株SMMC-7721用于后续实验。第三章RNAi靶向抑制DDAH2基因表达对肝癌细胞生物学行为影响目的:研究靶向抑制DDAH2基因的表达对人HCC细胞增殖、迁移及血管生成的影响。方法:将人肝癌SMMC-7721细胞分三组,分别为实验组(KD)、阴性对照组(NC)、空白对照组(CON)。实验组转染pGMLV-DDAH2-1慢病毒载体,阴性对照组转染阴性对照慢病毒载体,空白对照组不做处理。MTT检测细胞增殖活力,划痕实验检测细胞迁移活力,qPCR和Western blot分别从转录水平和翻译水平检测沉默DDAH2基因后VEGF mRNA和蛋白质表达情况。结果:MTT实验结果示KD组较NC组和CON组生长曲线平缓,SMMC-7721细胞生长速度明显减缓,差异具有显著性意义(p<0.05)。划痕实验结果示KD组较NC组和CON组细胞迁移率下降,具有显著性差异(p<0.05)。qPCR和Western blot结果分别从mRNA和蛋白水平检测VEGF表达变化,结果示KD组VEGF mRNA和蛋白水平较NC组和CON组均明显下降,结果均有显著性差异(p<0.05)。结论:1)沉默DDAH2基因可引起SMMC-7721细胞增殖减慢;2)沉默DDAH2基因对SMMC-7721细胞迁移能力产生抑制作用;3)沉默DDAH2基因可引起SMMC-7721细胞内VEGF表达下降,说明DDAH2可影响VEGF介导的血管生成作用。