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团头鲂(Megalobrama amblycephala),与斑马鱼同属鲤科鱼类,是一种代表性硬骨鱼类,在中国被广泛养殖。本实验室利用远缘杂交的方法以红鲫和团头鲂为亲本进行亚科间杂交,正反交得到了不同的结果。以红鲫为母本、团头鲂为父本正交产生的F1代鲫魴能成活,并有不同倍性后代。而反交组合,即以团头鲂为母本,红鲫为父本,所得后代鲂鲫在胚胎发育到34小时死亡。为了探究这一机制,我们从鲂鲫的母本团头鲂入手,探究其胚胎不同时期基因表达的差异,为研究鲂鲫胚胎发育中基因表达的差异提供参考。具体内容如下:1.取团头鲂受精后0、4、6、12、24、34小时(对应1细胞期、囊胚期、原肠期、原肠晚期、肌节期、出苗期)的胚胎材料,使用Illumina HiSeq 2000平台进行转录组从头测序。6个不同时期样品共测得原始序列26.98Gb,获得Raw reads 359,951,288条,当中有89.43%为Clean reads,被用到后续分析中。将所有样本得到的Clean reads混合组装为一个胚胎Unigene文件(All Unigene),此胚胎Unigene文件包括总长度为69,372,357bp,平均长度1077bp的共64,402条序列。各个时期(0、4、6、12、24、34小时)的样品各测得Unigene 32,291条、37,921条、46,733条、52,580条、62,785条和67,902条。各个时期Unigene序列的平均长度大于698bp。2.通过BLASTX(e-value?1e-5)将胚胎Unigene文件(All Unigene)与NCBI-NR,NCBI-NT,Swiss-Prot,KEGG,COG以及GO数据库进行比对。按照以上数据库的优先级,使用ESTScan软件为辅助,对蛋白编码框序列(CDS)进行了预测。对注释到COG和GO数据库的Unigene进行了功能分析。用组装出来的Unigene作为参考序列,通过SSR软件MicroSAtellite(MISA),进行了SSR分析。使用SOAPsnp检测样品的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)进行SNP的筛选和过滤。利用本地BLASTX(e-value?1e-6)方法,将Unigene序列注释到Ensembl数据库,找到了每一个Unigene所对应的基因名称。0、4、6、12、24、34小时样品注释到Ensembl数据库并找到对应基因名称的序列各有9709条、11404条、11393、13046条、15014和14809条。3.使用FPKM(Fragments Per kb per Million fragments)法计算基因的表达量,首先对差异基因进行了初步筛选,将差异表达基因定义为FDR≤0.001且FPKM倍数差异在2倍以上,并对10个组合(0vs34,4vs0,4vs6,4vs12,4vs24,4vs34,6vs0,6vs12,12vs24,24vs34)的样本进行了差异表达基因的对比和统计。在此基础上,我们设置了更严格的标准,划分出差异表达基因和稳定表达基因。FPKM倍数差异在4倍以上且p-value≤0.05,定义为差异表达基因;FPKM倍数差异在4倍以下且p-value?0.05的基因,则认定为稳定表达基因。对稳定表达基因和差异表达的基因,分别进行了GO功能分析。