CacyBP （CalCyclin（S100A6）-binding-protein,钙周期素结合蛋白）,是1998年发现的以钙依赖的方式结合CalCyclin的蛋白;2001在研究P53刺激下β-catenin泛素化降解新通路时发现,SIP（Siah-1 Interacting Protein）,通过与泛肽连接酶（Skp1-Cullin-F-box,SCF Ebi）结合,参与P53刺激下β-catenin的降解。进一步的研究发现:SIP即CacyBP,因此目前命名为CacyBP/SIP。CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白,S100家族是Ca²⁺结合蛋白家族中最大的亚类,以组织特异性的方式作为钙信号的传导器,与特异的靶蛋白相互作用,介导钙信号对细胞的调控。现发现CacyBP/SIP可与S100A1、A6、A12、B、P结合,它们均与肿瘤的进展/转移有关。近有研究表明CacyBP/SIP与细胞分化、发育有关。在研究小鼠受孕子宫发育时发现,随着时间的推移,CacyBP/SIP的表达逐渐升高,第7天时达高峰,其表达受雌、孕激素的调节,表明它与受孕子宫内膜细胞的发育有关;心肌肥大时CacyBP/SIP表达上调,随后的研究发现它可促进H9C2细胞及小鼠心肌的分化及DNA合成。已有两家研究机构报道,在神经细胞内CacyBP/SIP具有依赖于Ca²⁺浓度的核转位及磷酸化现象。Ca²⁺是细胞内最重要的第二信使,通过其浓度的变化来传递信息。在神经细胞内Ca²⁺浓度升高,CacyBP/SIP转位至细胞核,同时发生磷酸化;细胞内Ca²⁺浓度降低时,CacyBP/SIP转位至细胞浆,同时发生去磷酸化。蛋白转位至细胞核且发生磷酸化对于传递细胞外信号,调控下游基因表达具有重要意义。但这种现象究竟有何意义呢?本课题将对此进行探讨。【目的】1、CacyBP/SIP单克隆抗体的制备;2、CacyBP/SIP在正常组织和肿瘤组织中的表达分布;3、CacyBP/SIP在结肠癌组织中的表达及功能;4、CacyBP/SIP核转位影响结肠癌细胞功能的可能机制。【方法】1、应用淋巴细胞杂瘤技术制备小鼠源性抗人CacyBP/SIP MAb,采用Western Blot及ELISA等方法鉴定抗体的特异性和敏感性;2、应用正辛酸-饱和硫酸铵方法纯化抗体,通过SP免疫组织化学技术,观察CacyBP/SIP在正常组织和肿瘤组织中的分布;3、利用免疫组化、Western Blot观察CacyBP/SIP在结肠癌、癌旁组织、结肠癌细胞中的表达和细胞定位;4、通过基因重组方法构建CacyBP/SIP的siRNA载体、全长载体、C端截短体;5、间接免疫荧光细胞内染色、Western Blot检测CacyBP/SIP在胃泌素诱导下在结肠癌细胞中的定位;6、利用细胞MTT实验、平皿克隆形成试验、细胞周期检测等研究CacyBP/SIP入核对结肠癌细胞SW480和HT29增殖的影响;7、通过Western Blot、激酶实验、co-IP观察CacyBP/SIP入核后细胞周期蛋白及活性的变化;8、应用蛋白酶抑制剂通过抑制泛素-蛋白酶体通路探讨细胞周期蛋白改变的机制;9、利用激光共聚焦观察C端截短体在细胞内定位;10、利用Western Blot、co-IP观察CacyBP/SIP截短体转染细胞后细胞周期蛋白表达变化。【结果】1制备了CacyBP/SIP单克隆抗体获得3株抗CacyBP/SIP的单克隆抗体,其亚型均为IgG（κ）亚类,间接ELISA测定腹水效价达1×10^-7,Western Blot及ELISA表明三株MAb具有较高的特异性与敏感性,均能识别组织及细胞内天然及变性CacyBP/SIP蛋白。2 CacyBP/SIP在正常及肿瘤组织中的分布以获得单抗为工具,较系统研究CacyBP/SIP在正常组织及肿瘤组织中的表达。通过IHC染色发现:心脏、脑中CacyBP/SIP呈强染色,主要表达于心肌细胞、神经元及神经胶质细胞;在胃、结肠、肝等弱表达或表达缺失。在大多数腺上皮起源的肿瘤中,CacyBP/SIP均着色,包括胃癌、结肠癌、直肠癌等,其中在胰腺癌中显示出较强的着色,在鼻咽癌中着色最强。CacyBP/SIP亦可在鳞状上皮起源的肿瘤中着色,如肺鳞癌及食道鳞癌。我们还发现CacyBP/SIP在其它细胞来源的肿瘤中着色:如膀胱/输尿管移行细胞癌,神经胶质瘤,骨肉瘤。在肝癌、黑色素瘤及卵巢癌中着色罕见或缺失。CacyBP/SIP在多数正常组织不表达或弱表达,而在多数肿瘤组织中表达或表达增强,这一结果提示CacyBP/SIP可能在肿瘤的发生发展起作用。3 CacyBP/SIP在结肠癌中高表达我们利用免疫组化技术检测了CacyBP/SIP在10例正常结肠粘膜,50例结肠癌及癌旁组织中的表达,发现CacyBP/SIP主要定位于结肠癌细胞的胞浆和胞核,在正常结肠粘膜表达缺失,结肠癌表达阳性率（51%）,明显高于癌旁组织（26%,p<0.05）。Western Blot显示CacyBP/SIP在结肠癌中的表达明显高于相应癌旁组织（p<0.05）。对3种结肠癌细胞系中CacyBP/SIP表达显示,HT29及SW480细胞中均表达CacyBP/SIP。以上研究结果说明CacyBP/SIP在结肠癌中高表达,可能在结肠癌的发生发展中起作用。4胃泌素可诱导CacyBP/SIP转位至细胞核胃泌素作为内分泌激素,除具有促进胃酸分泌的功能,还是体内重要的生长因子,研究已证实它可促进正常结肠粘膜及结肠癌的增殖,与受体结合后可升高细胞内钙离子;而CacyBP/SIP具有依赖钙离子浓度的核转位。那么,胃泌素可否诱导CacyBP/SIP核转位呢?我们给予胃泌素刺激后,间接免疫荧光、Western Blot显示CacyBP/SIP转位至细胞核。我们进而构建了CacyBP/SIP的两个siRNA载体,稳定转染了结肠癌SW480和HT29细胞,发现CacyBP/SIPsi1载体能显著抑制结肠癌细胞中CacyBP/SIP的表达,命名为SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi,此细胞在胃泌素刺激后,间接免疫荧光、Western Blot显示CacyBP/SIP无转位现象发生。我们通过给予胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位,建立了研究CacyBP/SIP入核功能的细胞模型;通过抑制CacyBP/SIP的表达,建立了研究CacyBP/SIP入核受抑的细胞模型。5 CacyBP/SIP入核可促进结肠癌增殖我们采用MTT法、平皿克隆形成试验探讨胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位后对结肠癌细胞增殖的影响,结果发现:与未加胃泌素的对照细胞相比,给予胃泌素后促细胞增殖的作用增强（P<0.05）,促细胞集落形成明显增加（P< 0.05）;细胞周期结果表明:与未刺激组相比,给予胃泌素后,SW480与HT29细胞的G1期明显缩短。在SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi中,CacyBP/SIP入核受抑,MTT、平皿克隆形成试验表明:与未加胃泌素的对照细胞相比,给予胃泌素后细胞增殖的差别无显著性差异（P>0.05）,促细胞集落形成的能力无明显差异（P>0.05）。细胞周期结果表明:与未刺激组相比,给予胃泌素后,SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi细胞的G1期无明显变化。以上研究提示CacyBP/SIP核转位可促进结肠癌增殖,这种增殖作用可能通过促进细胞周期进展而实现的。6 CacyBP/SIP通过增强泛素介导的P27^kip1降解促结肠癌增殖为进一步明确CacyBP/SIP核转位后促进细胞周期进展的分子机制,我们首先应用Western Blot检测G1期进展中关键细胞周期蛋白的表达。应用同步化药物nocodazole处理结肠癌细胞SW480及HT29,结果表明:胃泌素刺激后,P27^kip1表达降低,Cyclin E蛋白表达升高。抑制CacyBP/SIP核转位后P27^kip1与Cyclin E的表达无变化。Cdk2激酶活性检测明显升高,同时细胞中P27^kip1结合Cdk2的量减少。以此结果提示CaycBP/SIP入核后P27^kip1蛋白量减少,Cdk2激酶活性增加,导致G1期进展。给予蛋白酶体抑制剂MG132抑制26S蛋白酶体的活性,结果发现: MG132处理细胞后,P27^kip1、Cyclin E表达无明显变化,说明P27^kip1降解的增强是通过26S蛋白酶通路。P27^kip1是SCF泛素酶的靶蛋白,研究已发现CacyBP/SIP通过其C未端与Skp1结合,我们应用CacyBP/SIP免疫共沉淀亦证实:在结肠癌细胞HT29及SW480中,CacyBP/SIP可以与Skp1结合。我们进而构建了CacyBP/SIP的截短体,CacyBP/SIP （Δ73–228）,缺失了C末端结构域,并克隆入pEGFP/C1表达融合绿色荧光蛋白的质粒pEGFP/C1- CacyBP/SIP （Δ73–228）。转染SW480-CacyBP/SIPsi细胞,激光共聚焦观察C端截短体在胃泌素刺激后亦可入核。免疫共沉淀证实,该截短体不能与Skp1结合,与此同时,P27^kip1的表达则无明显变化。这一结果说明CacyBP/SIP通过与Skp1结合,增强了泛素-26S蛋白酶体复合物对P27^kip1的降解。【结论】本研究发现胃泌素诱导CacyBP/SIP入核后通过增强泛素介导P27^kip1的降解促进结肠癌细胞的增殖。