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腹膜在高糖透析液的长期刺激下,可以引起结构和功能发生改变,导致超滤失败,使尿毒症病人不得不放弃腹膜透析治疗,转向其他肾脏替代治疗。腹膜纤维化是超滤失败的主要原因之一。课题组前期研究发现转录因子,血清反应因子(serum response factor,SRF)在高糖刺激后的HPMCs中表达增加,并且具有促进高糖刺激所诱导的人腹膜间皮细胞表型转换的作用。但是,其究竟是通过何种机制调控人腹膜间皮细胞的表型转换,目前未见相关研究报道。mi RN A是一种小的、非编码RNA,主要是通过抑制其靶基因,而发挥其生物学作用。很早以前科学家们就发现了mi RNA的存在,但是一直认为其是伴随基因转录过程中,生成的“垃圾”产物,并无任何实质性的功能。自从1993年哈佛大学的Lee RC教授,首次报道了mi RNA具有转录后调控作用后,越来越多的研究表明,其在胚胎发育、组织修复、细胞增殖及凋亡,以及肿瘤的发生和发展过程中,发挥着重要的作用。文献报道,miRNA-143/145在多种肿瘤组织中的表达降低,并且与其侵袭和转移有一定的关系。我们课题组预实验发现在高糖刺激后的人腹膜间皮细胞中,其表达量明显增加。那么,它们是否参与了人腹膜间皮细胞的表型转换呢?迄今为止,并不是很清楚。TPM4是原肌球蛋白家族中的一员,目前对其研究甚少。我们发现,在高糖刺激后腹膜间皮细胞中,TPM4蛋白的表达明显降低。这提示TPM4可能在腹膜间皮细胞的表型转换过程中,发挥一定的作用。生物信息学预测,发现TPM4是mi RNA-143/145下游靶基因之一,并且在细胞系中,它们的表达呈负性相关关系。那么,mi RNA-143/145和TPM4是否参与了高糖刺激所诱导的细胞表型转换?他们二者是否能够结合,又是如何结合?这些问题将是本课题的研究重点。【目的】1.观察mi RNA-143/145和TPM4在高糖刺激后的腹膜间皮细胞中的表达情况及其功能;2.验证miRNA-143/145和TPM4之间的关系;3.验证SRF和mi RNA-143/145之间的关系;【方法】1.利用D型葡萄糖刺激人腹膜间皮细胞,通过western blot和qRT-PCR技术,检测mi RNA-143/145和TPM4的表达情况;2.利用mi RN A-143/145 mimic和inhibitor进行瞬时转染,建立过表达和功能抑制细胞系,观察其在细胞表型转换中的作用;3.TPM4慢病毒转染细胞,建立过表达和干扰细胞系,观察其在细胞表型转换中的作用;4.联合多个数据库,预测mi RN A-143/145的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因验证;5.SRF慢病毒转染细胞,建立过表达和功能缺失细胞系,观察mi RN A-143/145的表达变化;【结果】1.mi RN A-143/145在高糖刺激后的HPMCs中的表达增加,并且其具有促进细胞表型转换的作用利用50mmol/L D-型葡萄糖刺激HPMCs,通过q RT-PCR检测mi RNA-143/145的表达情况,结果发现mi RNA-143/145的表达增加,并且具有时间依赖性;随后,通过转染mi RNA-143/145 mimic和inhibitor,证明了mi RNA-143/145具有促进细胞表型转换的作用。2.TPM4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中的表达降低,并且其具有抑制细胞表型转换的作用Western blot和q RT-PCR结果显示,高糖刺激可以降低其蛋白的表达,但不影响其m RNA的表达,通过慢病毒转染,分别建立了过表达和干扰细胞模型,发现其具有抑制细胞表型转换的作用。3.mi RN A-143/145和TPM4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中表达负相关,并且二者可以结合综合上述1和2的western blot和q RT-PCR结果表明,高糖刺激后,mi RN A-143/145和TPM4蛋白的表达负性相关,但是其m RNA的表达无明显变化;联合Targetscan、Micro Cosm和mi Rbase三个mi RNA靶基因数据库预测,发现,TPM4为mi RN A-143/145下游靶基因之一,利用了双荧光素酶报告基因,证实mi RNA-143/145可以与TPM4 3?-UTR相结合4.SRF可以正向调控mi RNA-143/145的表达通过慢病毒转染,我们建立了SRF过表达和干扰细胞模型,利用q RT-PCR技术检测mi RN A-143/145的表达,结果提示,SRF可以调控mi RNA-143/145的表达,表明细胞体内存在SRF-mi RNA-143/145-TPM4信号轴。【结论】通过对高糖刺激后的HPMCs中SRF、mi RNA-143/145和TPM4表达的研究,我们证实了高糖刺激后,HPMCs中mi RNA-143/145的表达增加,其上游受到SRF的调控,其下游调控TPM4蛋白水平的表达,从而调控细胞表型的转换。因此,SRF-mi RNA-143/145-TPM4这条新的信号轴存在于高糖刺激的HPMCs中,这对于进一步了解高糖刺激所诱导的细胞表型转换的机制有了新的认识,为腹膜纤维化的治疗提供了新的干预靶点。