研究背景慢性缺氧普遍存在于心脏的生理或病理状态,如胚胎发育、冠心病、紫绀型先天性心脏病和动脉粥样硬化等。尤其对于紫绀型先天性心脏病患者,长期处于慢性缺氧和异常血循环的双重负担下,其手术风险增加,远期生存率下降。然而,在临床上发现许多这类轻-中度紫绀的患儿在较长的时间内能顺利存活,同时在接受心脏外科手术时能够较好地耐受手术,且在围手术期也少有进展到心衰,提示在长期患病的过程中心脏对慢性缺氧产生了一定程度的保护性适应。因此,深入研究心肌在慢性缺氧条件下的损伤与适应机制对于改善缺氧心肌保护的策略将大有裨益。许多研究围绕这些机制进行了探讨,其涉及到的基因数目众多。为了能更加准确地找到相关基因,生物信息学和高通量测序技术的结合能提供强大的帮助。因此,对紫绀型先天性心脏病心肌标本的下一代测序（next-generation sequencing,NGS）数据进行生物信息学分析,可以为找到心肌组织中与缺氧高度相关的基因提供有力的线索。c-Jun为原癌基因JUN（Jun proto-oncogene,JUN）编码的蛋白,是活化蛋白-1（activator protein-1,AP-1）的重要组成部分之一,也是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）这条通路上级联反应激活的重要终点,常常参与细胞的增殖、凋亡与转化等生物学过程。在缺氧应激条件下MAPK/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）/c-Jun途径被激活,常参与JNK介导的细胞凋亡。在既往研究中,一部分研究显示c-Jun具有促细胞凋亡的作用,而另一部分则表明c-Jun起到抗凋亡、促增殖的作用。在慢性缺氧条件下,心肌细胞中c-Jun及其磷酸化的表达是增加的,但它对于心肌细胞凋亡与存活的具体作用仍不明了。因此,深入探讨c-Jun与心肌细胞生存相关的下游机制可能为缺血性心脏病的心肌保护提供一个潜在的治疗靶点。研究目的本研究拟利用生物信息学方法,分析法洛氏四联症（tetralogy of Fallot,TOF）患者心肌组织的转录组下一代测序数据,找到与慢性缺氧高度相关的差异化表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,将其中筛选出的基因JUN（编码c-Jun蛋白）作为后期研究的关键基因;进一步在体外建立慢性缺氧的细胞模型,利用siRNA对JUN基因进行敲减,检测细胞凋亡情况、凋亡相关蛋白的表达以及同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog,PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB,also known as Akt）信号通路的变化,同时观察JUN敲减对细胞周期进程的影响,从而明确c-Jun在慢性缺氧H9c2心肌细胞凋亡中的作用。研究方法1.慢性缺氧心肌标本的生物信息学分析1.1从GEO（Gene Expression Omnibus,GEO）公共数据库下载实验号为GSE36761的转录组NGS数据,利用fastqc、fastx_clipper和fastq_quality_filter等软件对数据进行清理和质量控制。1.2下载人类UCSC（University of California Santa Cruz,UCSC）hg38基因组参考序列文件,在ubuntu16.04 LTS系统下利用HISAT2软件将测序序列片段比对到参考序列,再利用HTSeq软件对测序序列片段进行计数;在Windows 7系统下,利用R语言中DESeq2软件将计数数据进行格式转换,写入分组信息,采用hclust命令进行层次聚类分析,剔除离散样本,最后再利用DESeq2软件进行两组样本的差异分析,筛选出差异倍数大于2倍的基因,并写入基因名注释信息。1.3利用R语言中org.Hs.eg.db软件将数据中的基因名（gene symbols）转换为ENTREZ IDs,然后利用富集分析软件clusterProfiler对DEGs进行基因本体的生物学功能（gene ontology biological process,GO_BP）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,找到DEGs富集的生物学意义;进一步利用在线数据库基因/蛋白质相互作用的检索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,STRING）分析这些DEGs之间的相互作用,并取得蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）数据,将得到的数据导入Cytoscape网络分析软件,计算节点（基因）之间的关联度,找到“热点”基因,并绘制网络互作图。2.建立慢性缺氧细胞模型,筛选细胞活力明显改变及c-Jun转录和蛋白表达出现峰值的时间点2.1将体外培养的H9c2大鼠心肌细胞株放置在无血清的培养液中饥饿过夜后转移到1%O₂的Invivo2000细胞培养舱中分别培养0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h。2.2在各时间点,利用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）检测细胞的活力并绘制慢性缺氧条件下H9c2细胞的生长曲线,使用定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）技术测定c-Jun的转录情况,Western blot技术检测c-Jun蛋白的表达及其磷酸水平,找到c-Jun表达出现峰值的时间点。3.研究c-Jun在慢性缺氧的H9c2细胞凋亡和细胞周期中的作用3.1在H9c2心肌细胞缺氧培养24 h后,利用特异性siRNA+Lipofectamin2000脂质体转染的方法敲减JUN基因,qRT-PCR和Western blot检测转染干扰效果。细胞设置为两组:JUN敲减组（si-JUN）和阴性对照组（si-NC,仅含有空脂质体）。3.2为了观察JUN敲减后细胞的存活状况,分别用CCK-8检测法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）检测法检测两组细胞的活力和死亡率,同时通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端缺口标记（terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）法和流式细胞仪法分析细胞的凋亡情况。Western blot测定cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2样11（B-cell lymphoma-2 like 11,Bim）和Bcl-2相关X（B-cell lymphoma-2-associated X,Bax）等凋亡蛋白的表达水平,以明确c-Jun与凋亡信号通路之间的关系。3.3利用Western blot检测两组细胞PTEN、磷酸化PTEN、Akt和磷酸化Akt的蛋白表达水平,以明确c-Jun与PTEN/Akt信号通路之间的关系。3.4流式细胞仪分析两组细胞的细胞周期进程,计算各细胞周期时相的细胞数目比例,以明确JUN敲减对细胞周期的影响。实验结果1.29个样本经过数据清理和聚类分析,剔除5例离散样本（均来自TOF组）后,共筛选出TOF心肌中有1260个差异倍数>2倍的DEGs,其中上调基因494个,下调基因766个。GO和KEGG信号通路富集分析显示,共有926个DEGs富集在83条GO生物学过程,这些生物学过程多与慢性缺氧条件下的炎症反应有关,部分也与细胞的有丝分裂和存活有关;另有406个DEGs富集在13条KEGG信号通路,这些信号通路多与细胞信号转导、细胞凋亡与存活有关。2.基于PPI数据的基因网络关联度分析显示,关联度分值>25分的“热点”基因有6个,分别是G蛋白β4亚单位（G protein subunitβ4,GNB4）、c-c基序趋化因子受体（C-C motif chemokine receptor 2,CCR2）、c-c基序趋化因子受体1（C-C motif chemokine receptor 1,CCR1）、血小板因子4（platelet factor 4,PF4）、β-连环蛋白（cateninβ1,CTNNB1）和JUN。其中,JUN（编码c-Jun蛋白）同时富集在“regeneration”的生物学过程和“apoptosis”信号通路中。3.H9c2细胞在分别缺氧培养0h、6h、12h、24h、48h和72h,与其他时间点相比,缺氧24 h后的细胞活力水平显著升高。进一步发现,c-Jun mRNA、c-Jun蛋白和磷酸化c-Jun蛋白的表达量在缺氧24h后出现表达峰值。因此,选择缺氧后24h作为后续研究的时间点。4.与si-NC组相比,经siRNA转染干扰后,c-Jun mRNA和蛋白的表达量显著降低,达到了预期转染目的。同时,在缺氧24h后,si-JUN组细胞的活力较si-NC组显著下降,而细胞的死亡率则明显上升。5.与si-NC组相比,在缺氧24h后,si-JUN组细胞凋亡数量增加,并检测发现,si-JUN组细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax和Bim等促凋亡蛋白的表达水平显著增加。6.与NC组相比,在缺氧24h后,si-JUN组细胞中PTEN蛋白的表达水平并没有改变,但其磷酸化水平增加。同时,PTEN/Akt信号通路下游的Akt蛋白水平也没有变化,但其磷酸化水平下降。7.与NC组相比,在缺氧24h后,si-JUN组细胞的G₁/G₀期细胞百分比显著增加,G₂/M期细胞百分比减少。结论1.GNB4、CCR2、CCR1、PF4、CTNNB1和JUN（编码c-Jun）等6个“热点”基因与炎症反应、细胞凋亡和细胞存活等生物学过程和信号通路密切相关,其中JUN可能参与心肌慢性缺氧适应的机制。2.慢性缺氧条件下,JUN的敲减使缺氧心肌细胞的活力显著下降,细胞死亡率及凋亡数量明显增加,同时也使促凋亡蛋白表达水平显著增加,提示c-Jun在慢性缺氧条件下可维持细胞活力,参与负向调控H9c2心肌细胞的凋亡。3.JUN的敲减使PTEN蛋白磷酸化水平增加,进而抑制了Akt蛋白磷酸化,提示c-Jun可能间接通过PTEN/Akt信号通路促进了慢性缺氧条件下H9c2心肌细胞的存活。4.JUN的敲减抑制了细胞周期从G₁期进展到S期和G₂期,提示c-Jun对慢性缺氧条件下H9c2心肌细胞周期的进程起到维持或正向推动作用。