肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，严重危胁人类健康。目前，药物抗肿瘤治疗疗效仍不理想，主要原因在于传统的抗肿瘤药物在杀伤患者体内肿瘤细胞的同时，其巨大的毒副作用不可避免。因此，寻找新型高效且低毒的抗肿瘤药物是生物医药领域的重大课题。天然产物化学研究一直是制药业新药研制的重要途径和主要来源，天然产物成分具有结构新颖、疗效高、毒副作用小等优点，所以目前天然产物化学及其研究成果已广泛应用于医药业。Sansalvamide A是1999年被报道的从海洋真菌中分离出的一种天然环五肽酯，具有很高的亲脂性及显著的抗肿瘤能力。Sansalvamide A环肽是由Sansalvamide A改造所得到的一类化合物。经过多年的研究，新报道的Sansalvamide A环肽具有200余种，其中很多衍生物的活性明显提高。在本课题中，由河北科技大学药用分子化学重点实验室提供了9种新合成Sansalvamide A环肽衍生物，选取小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞三种细胞模型做体外抗肿瘤活性研究，观察这9种新化合物的抗肿瘤活性。同时，应用细胞培养技术原代培养人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞，用于研究9种新化合物对这两种正常细胞模型生长的抑制作用。通过抗肿瘤活性筛选，选择活性较好的化合物5（H-10）和化合物9（H-15）为研究重点，用小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为模型，对化合物H-10和化合物H-15抑制肿瘤细胞增殖的机制做进一步研究。具体研究内容和结果如下：第一部分Sansalvamide A环肽衍生物抗肿瘤活性及对正常细胞毒性的研究目的：9种新型SansalvamideA环肽衍生物抗肿瘤活性筛选及其对正常细胞毒性的研究。方法：应用细胞培养技术培养小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞，做为肿瘤细胞模型用于9种新型SansalvamideA环肽衍生物抗肿瘤活性筛选。原代培养人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞，用于研究9种新化合物对这两种正常细胞模型生长的抑制作用。磺酰罗丹明B（SRB）比色分析法分析结果。到置相差显微镜观察化合物作用不同时间后B16细胞，淋巴细胞和大鼠平滑肌细胞（VSMC）形态，数量及生长状态的变化情况。结果：19种Sansalvamide A环肽衍生物对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用，用SRB比色法测定空白组以及1%DMSO组48h后吸光度（OD）值，通过比较发现1%DMSO（溶解化合物溶剂的最大量）对B16，MCF-7和MDA-MB-231三种细胞的增殖无影响，P>0.05。除化合物6，8和9在50μM对MDA-MB-231增殖无抑制作用外，9种化合物对这三种细胞都显示出了抗肿瘤活性。对于B16细胞，化合物2，5和6抑制率最强，分别为82.43%，81.79%和83.19%；对于MCF-7细胞，抑制率最强的三种化合物分别为化合物5，64.19%，化合物9，51.08%和化合物4，50.89%；对于MDA-MB-231细胞，化合物4和5作用最强，抑制率分别为68.04%和66.56%。29种化合物对人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞的增殖无明显抑制作用。3化合物H-10可使B16细胞出现凋亡和分化的形态学改变；化合物H-15可使B16细胞出现明显的分化形态改变。结论：9种SansalvamideA环肽衍生物具有抗肿瘤活性且对正常细胞毒性较小；化合物H-10对多种肿瘤细胞具有活性，考虑具有诱导B16细胞凋亡的作用；化合物H-15可能通过诱导B16细胞分化抑制其增殖。第二部分新型环五肽H-10抑制B16细胞增殖机制的研究目的：研究化合物H-10抑制B16细胞增殖的机制。方法：磺酰罗丹明B比色分析法研究化合物H-10抑制B16细胞增殖的浓度依赖性，细胞计数法绘制生长曲线研究化合物H-10抑制B16增殖的时间依赖性。流式细胞学技术分析B16细胞经化合物H-10作用后凋亡细胞DNA含量。Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-8和caspase-9表达的情况。结果：1化合物H-10抑制B16细胞生长具有浓度依赖性：1%DMSO组与空白组相比，增殖率无明显变化，P>0.05。经不同浓度化合物H-10（0.1、1、10、50和100μM）处理48h后，B16细胞增殖率逐渐降低。与对照组相比，100μM组P<0.01，50μM组P<0.01，10μM组P<0.05，其增值率均明显降低。同时在光学显微镜下可以明显观察到B16经化合物H-10作用后呈现的凋亡形态。经公式计算得到化合物H-10作用B16细胞48h的IC50（半抑制浓度）为39.68μM。2化合物H-10抑制B16细胞生长具有时间依赖性：经浓度为50μM的化合物H-10作用B16细胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后计数细胞数，与对照组相比，细胞生长受到明显抑制。3化合物H-10具有诱导B16细胞凋亡的作用：流式细胞学结果显示，经浓度为50μM的化合物H-10作用B16细胞24h后，出现明显DNA亚二倍体峰，凋亡细胞比例为(9.21±4.62)%，与对照组凋亡比例(0.96±0.22)%相比，P<0.05，结果具有统计学意义。Western Blot结果显示，经10、30和50μM化合物H-10作用后，caspase-3随药物浓度升高其表达量上升。4化合物H-10诱导B16细胞凋亡通过线粒体途径：经10、30和50μM化合物H-10作用后，通过线粒体途径诱导细胞凋亡的caspase-9随药物浓度升高其表达量上升，而与外源性凋亡相关的caspase-8没有明显变化。结论：化合物H-10对B16细胞的增殖具有很强的抑制作用，且作用效应具有显著的浓度依赖性和时间依赖性。化合物H-10作用B16细胞48h的IC50为39.68μM。化合物H-10具有诱导B16细胞凋亡的作用，化合物H-10诱导B16细胞凋亡通过线粒体途径。第三部分新型环五肽H-15抑制B16细胞增殖机制的研究目的：研究化合物H-15抑制B16细胞增殖的机制。方法：磺酰罗丹明B比色分析法研究化合物H-15抑制B16细胞增殖的浓度依赖性，细胞计数法绘制生长曲线研究化合物H-15抑制B16增殖的时间依赖性。检测B16细胞经化合物H-15作用后黑色素分泌量的变化。RT-PCR检测B16细胞经化合物H-15作用后干细胞基因Foxd3，Klf4，Sox2和Nanog的表达。Western Blot检测酪氨酸酶，Sox2和Foxd3表达的情况。结果：1化合物H-15抑制B16细胞生长具有浓度依赖性：1%DMSO组与空白组相比，增殖率无明显变化，P>0.05。经不同浓度化合物H-15（0.1、1、10、50和100μM）处理48h后，B16细胞增殖率逐渐降低。化合物H-15作用B16细胞与对照组相比，50μM组和10μM组P<0.01，其增值率均明显降低。经公式计算得到化合物H-15作用B16细胞48h的IC50为69.44μM。2化合物H-15抑制B16细胞生长具有时间依赖性：经浓度为50μM的化合物H-15作用B16细胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后计数细胞数，与对照组相比，细胞生长受到明显抑制。350μM化合物H-15作用B16细胞48h后细胞黑色素含量较对照组增高：经酶标仪测定50μM化合物H-15作用B16细胞48h后吸光度值为0.1743±0.0227，对照组吸光度值为0.0788±0.0039，两组间比较P<0.01，差异具有统计学意义，说明经化合物H-15作用后的B16细胞分泌黑色素含量明显增加。450μM化合物H-15作用B16细胞48h后酪氨酸酶（TYR）的表达增加：经浓度为50μM的化合物H-15作用B16细胞48后，酪氨酸酶（TYR）的表达较空白组增高。5化合物H-15具有抑制Sox2, Foxd3基因表达的作用：RT-PCR结果显示，经10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表达呈下降趋势，Klf4的表达没有明显变化，Nanog的表达没有规律性。Western-blot结果显示，经10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表达呈下降趋势。说明化合物H-15具有抑制B16细胞干细胞特性的作用。结论：化合物H-15对B16细胞的增殖具抑制作用，且作用效应具有显著的浓度依赖性和时间依赖性。化合物H-15作用B16细胞48h的IC50为69.44μM。化合物H-15具有诱导B16细胞分化的作用，经化合物H-15作用过的B16细胞分泌黑色素的能力增强。化合物H-15抑制了B16细胞Sox2和Foxd3的表达，使其肿瘤干细胞的特性受到抑制。