受精和胚胎发生的调控机理一直是发育生物学研究的热点。对配子和早期胚胎的转录谱研究是发现受精和胚胎发生过程中调控因子的重要手段。由于精细胞包裹在营养细胞内,而卵细胞和早期胚胎包裹在母体组织之中,数据库中来自配子和早期胚胎的转录本非常有限。本文以双子叶植物烟草SRI为材料,手工分离了精细胞,卵细胞,合子和二胞原胚,并利用SMARTTM技术分别构建了四种细胞类型特异的cDNA文库。通过随机挑选4个文库中的克隆测序并在此基础上对四种细胞的表达谱进行了分析。此外,重点探讨了早期胚胎发生过程中母本基因控制到合子基因控制的转换(maternal-to-zygotic transition)发生的时间及其特点。主要实验结果摘要如下：1利用烟草花粉管离体萌发结合手工分离得到4200对精细胞；通过酶解法结合研磨,得到159个卵细胞,143个合子和149个二胞原胚。在分离过程中,加入了RNA合成抑制剂：actinomycin D (50 mg/L)和cordycepin(100 mg/L),抑制在细胞分离过程中应激基因的转录。通过SMARTTM cDNA Library ConstructionKit成功构建了四种细胞类型特异的全长cDNA文库。精细胞,卵细胞,合子和二胞原胚cDNA文库的滴度分别为1.43×106/ml,4.42×106/ml,4.4×106/ml,5.4×106/ml；重组率均超过99%,文库中重组克隆的插入片段平均长度分别为600bp,600bp,800bp,700bp,均符合cDNA文库构建的要求。这是首次在双子叶植物中构建卵细胞,合子和二胞原胚cDNA文库的尝试,为研究配子转录谱和早期胚胎发生过程中转录谱的变化奠定了基础。2我们在文库中随机挑选克隆测序,共得到了8334个EST。其中精细胞,卵细胞,合子和二胞原胚文库分别得到1865,1964,2356,2149个EST,聚类后得到1110,1307,1583,1248个cluster。信息学分析表明精细胞中翻译,基础代谢和蛋白加工相关的基因比例和另外三种细胞相比较低,并且新发现的cluster比例最高,占其总数的27%。卵细胞具有和合子以及二胞原胚相仿的代谢水平,同时我们也发现了大量的ECA1基因的表达。和卵细胞相比,合子和二胞原胚的转录谱在整体水平上保持了较高的相似度,说明受精之后合子的转录谱发生了明显的变化,而分裂之后二胞原胚转录谱的变化并不大表明而二者可能存在类似的发育调控机制。在受精之后,组蛋白的含量在合子和二胞原胚中显著增加,表明在合子时期已经有来源于胚胎基因组的新转录本,这也说明合子基因激活(Zygotic gene activation)在合子时期已经开始。3在各个文库中选取数个cluster,通过RT-PCR对其在精细胞,卵细胞、合子、二胞原胚以及其他组织中的表达特性进行了分析。结果表明,精细胞中存在大量特异表达的功能未知基因。卵细胞中有部分转录本在合子和二胞原胚中未检出,暗示其可能在受精后被降解,这也说明在合子中已经开始了对卵细胞遗留mRNA的降解。合子和二胞中存在数个特异的转录本,在受精之前的卵细胞中并‘无表达,这表明在合子时期基因组具备转录活性并且产生了新转录本。结合在合子中发现的母本来源的mRNA开始降解,并且伴随有新转录本的产生两方面的证据,我们认为,在双子叶植物烟草中,早期胚胎发生由母本基因控制到合子基因控制的转换(MZT)在合子时期就已经开始。4我们对合子中新出现的五个转录本作了进一步分析,其中一个cluster被发现和dynamin基因高度同源,我们将其命名为NtDynamin。通过blast确定已知片段具有完整的编码序列,在此基础上,我们通过Genome walking获取了基因上游大约1000bp的启动子序列,将其连接报告基因(GUS和GFP)后同时转入拟南芥和烟草,并对拟南芥中的启动子的表达模式进行了初步分析。