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浩瀚无垠的海洋环境中拥有着丰富的自然资源,其中海藻和细菌的种类尤其丰富。海藻中富含许多琼胶,而琼胶寡糖可以被琼胶降解菌降解产出,拥有很广的用途。然而制造琼胶寡糖的技术却是一个急需攻克的技术难题。目前主要采用的是酶水解法和化学法,其中酶水解法反应温和,消耗量少,同时具有专一性和高效性,成为制备琼胶寡糖最常用的方法。本实验室从海洋环境中分离筛选的出3株具有降解琼胶功能的海洋琼胶降解菌,分别编号为FG4、FG7和FG8。在显微镜下观察其形态学特征,并进行革兰氏染色和抗生素抗性实验,结果发现:FG7和FG8均为粘稠状橘红色菌落;在对氨辛青霉素(Ampicillin,Amp)、氯霉素(Chloramphenicol,Cm)、羧苄青霉素(Carbenicillin,Cb)和硫酸链霉素(Streptomycin sulfate,Str)的抗性实验中,FG7 对氯霉素(Chloramphenicol,Cm)和硫酸链霉素(Streptomycin sulfate,Str)具有抗性,FG8对氯霉素(Chloramphenicol,Cm)具有抗性。以细菌鉴定的通用引物1492R和968F对细菌进行鉴定,将获得的目的片段经过电泳检测,回收DNA片断,通过连接转化,选出克隆成功上的连到载体上的,再用T载体引物M13R(-48)和M13F(-47)进行菌液PCR扩增检测。对鉴定的16SrDNA目的片段测序,测序序列通过BLAST比对和同源性分析,初步确定FG7为弧菌属(Vibrio sp.),FG8为产微球茎属(Microbulbifer sp.)。为了进一步研究获取琼胶降解菌Vibrio sp.FG4的基因功能,利用染色体步移法对Vibrio sp.FG4的基因序列进行扩增。首先提取Vibriosp.FG4的总DNA,通过公布的琼胶酶基因序列找出与其具有同源性的基因,寻找这些基因的保守区域序列并进行引物的设计,设计出扩增保守区域的特异性引物,克隆出Vibrio sp.FG4基因的中间保守区域片段,然后利用染色体步移试剂盒提供的AP引物以及针对Vibrio sp.FG4基因组设计的特异性SP引物进行染色体步移,扩增Vibrio sp.FG4的基因片段,对克隆获得的片段进行测序。测序结果得到Vibrio sp.FG4基因的基因片段,命名为“agaFG4-B”。根据生物信息学分析表明,“agaFG4-B”基因大小为1830 bp,编码580个氨基酸,5’端的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)共有6个ORF,理论分子量为64.490 kDa,理论等电点pI值为10.86。通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastp比对和构建系统发育树比较分析,结果表明“agaFG4-B”与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的CY24 agarB的琼胶酶基因为同一聚簇,具有同源性,因此说明克隆得到的“agaFG4-B”为一种琼胶酶基因片段。结合上文得知通过基因克隆的最新技术,最终得到了 Vibrio sp.FG4的1条琼胶酶基因片断,不仅丰富了琼胶降解菌基因功能的信息,而且为今后琼胶降解菌在工业上的生产应用和全面了解琼胶降解菌的基因功能及后续的表达调控提供了理论依据。同时也促进了琼胶降解菌活性物质的表达调控机制的研究,使得开发利用琼胶降解菌生产功能性寡糖创造了一定的条件,加快了其在工业生产上的应用进程。