哺乳动物有三种不同类型的肌肉组织,包括心肌、骨骼肌和平滑肌。骨骼肌约占机体总质量的40%,在运动和代谢方面起着关键作用。脊椎动物的骨骼肌起源于胚胎发育时期的体节。肌肉发生是一个复杂的过程,涉及多个基因、信号通路和网络调控。例如,MYOG regulatory transcription factors（MRFs）对骨骼肌发育的调控非常重要。MRFs是基本螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的成员,包括MYOG、MyoD、Myf5和MRF4。在骨骼肌中显著表达的MRFs在骨骼肌的增殖和分化过程中起着重要作用。此外,非编码RNA如microRNAs（miRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（circRNAs）已被报道参与调控骨骼肌的发育,并在肌发生过程中发挥关键作用。虽然肌肉发育的分子机制一直是发育生物学的主要研究对象。然而,肌肉发育和肉质品质的分子调控机制有待进一步深入的研究。circRNA是一类内源性非编码RNA,它具有共价闭合的环状结构,没有5’端帽子和3’端poly（A）尾巴,与线性RNA分子相比更稳定,由前体mRNA反向剪接而成。circRNAs在真核细胞的细胞质中高表达,在特定发育阶段的各种细胞和组织中长期存在。circRNA根据期来源可分为（1）外显子circRNA（exonic circRNAs）,由编码基因外显子剪接而成,包括一个或多个外显子序列;（2）内含子circRNA（Intron circRNA,circular intronic RNA,ciRNA）,不含外显子序列,由编码基因内含子序列环化而产生;（3）外显子-内含子 circRNA（exon-intron circRNA,EiciRNA）,是一种包含外显子和内含子序列的融合circRNA。此外,发现circRNA通过不同的作用方式参与基因的转录和转录后调控。以往的研究表明,大多数circRNA包含miRNA结合位点。因此circRNA可以作为一种高效的竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）,有效地吸附miRNA,调控miRNA靶基因。除了吸附miRNA外,circRNA还可能与RNA结合蛋白（RBP）结合,形成RNA蛋白复合物（RPCs）。此外,有研究指出（EiciRNAs）与RNA聚合酶Ⅱ和U1小核核糖核蛋白相互作用,并在细胞核内顺式诱导宿主基因转录。研究表明circRNA在骨骼肌增殖和分化过程中发挥重要作用。MicroRNAs（miRNAs）的长度约为17～24个核苷酸,是一类内源性的小单链非编码RNA。通常,miRNA的序列与基因的3’非翻译区（3’-UTR）互补。这些互补序列在转录后水平通过促进mRNA的降解或抑制翻译过程来下调各种基因的表达。miRNA参与多种生理生化过程,如致癌、造血、神经发生、细胞增殖、细胞凋亡等。miRNAs通过调节肌原性增殖和分化,在肌肉发育过程中发挥重要作用。近年来,人们发现miRNA在肌肉发育中发挥着重要作用,而对miRNA的研究主要集中在对下游靶基因的调控上,对影响miRNA表达的因素的研究较少。目前对牛肌肉发育的研究较少,其调控机制尚不清楚。主要结果如下:1.circMYL1通过海绵吸附miR-2400抑制成肌细胞增殖并促进成肌细胞分化。在本实验中,试图评估circMYL1和miR-885在调节牛原代成肌细胞增殖和分化中的作用。通过 RT-qPCR、Western blot、Cell cycle、Cell counting kit-8 assay（CCK-8）、EdU等一系列实验方法研究了 circMYL1和miR-885在成肌细胞增殖和分化中的潜在作用。收集秦川牛胚胎期（90天）的,骨骼肌、胃、肠、脾、心、肝、肺和肾,用二乙焦碳酸酯（DEPC）水洗涤,在-80℃保存至RNA提取。使用TRIzol提取细胞或组织RNA。接下来,使用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用SYBR Green PCR混合试剂盒（Takara,中国大连）进行RT-qPCR。用GAPDH和U6作为内对照,每组三个生物学重复,采用2-ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。为了探索circMYL1在牛骨骼肌发育过程中可能的功能,从NCBI网站下载了牛肌肉组织circRNA的测序数据:Accession ID,GSE87908。为构建circMYL1过表达质粒,利用PCR扩增circMYL1的线性序列,用RT-PCR从牛原代成肌细胞RNA中制备cDNA模板。将得到的线性序列按照生产说明书克隆到pCD2.1载体（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）的KpnI和BamhI酶切位点,从而构建过表达载体pCD2.1-circMYL1。使用XhoI和NotI限制性内切酶（Takara,Dalian,中国）和T4 DNA连接酶,扩增MYOG 3 ’UTR-wt片段,包括miR-2400结合位点,并将其插入Renilla基因的3’端psiCHECK-2 载体（MYOG-wt）（Promega,Madison,WI,USA）。突变型psiCHECK-2-MYOG 3’UTR-MUT（MYOG-MUT）通过重叠 PCR 产生 miR-2400 种子区互补突变。MYOG-WT和MYOG-MUT最终以同样的方式构建到psiCHECK-2载体中。通过插入两个序列来补充Rluc psiCHECK-2载体后成熟的miR-2400序列,创建了一个 miR-2400 sensor（具有完美的 miR-2400 结合位点）。miR-885 mimics（Ribobio,广州,中国）序列为 UCCAUUACACUACCCUGCCUCU。psiCHECK2-Myod1-3’-UTR-MUT是通过使用诱变引物突变miR-885结合位点的互补种子区而生成的。测序验证了所有构建的载体。HEK293T细胞（ATCC,USA）和牛原代成肌细胞在含有10%或20%胎牛血清（FBS）（Hyclone,USA）和1%青霉素-链霉素（Invitrogen,USA）的高糖培养基（DMEM）中培养,37℃,5%C02孵育。当牛肌原代细胞融合度接近70%～80%时,用含2%马血清的分化培养基（DMEM）替代生长培养基诱导牛肌原代细胞分化。牛原代成肌细胞在六孔板中培养。增殖细胞融合达到40%或分化细胞融合达到70%～80%的细胞转染 PCD2.1-circMYL1（2 μg/mL）、100 nmol/L si-circMYL1（RiboBio,广州,中国）、50 nmol/L miR-2400 mimics（RiboBio,广州,中国）、miR-885 mimics、miR-885-control（NTC）、miR-885 抑制剂（IN）和抑制剂阴性对照（INC）。转染试剂使用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司,美国）。在细胞培养基中加入1 mmol/L的放线菌素D溶液可以抑制转录（Leagene,Beijing,China）。使用细胞计数试剂 kit-8C（CCK-8）（Multiscience,Hangzhou,China）评估细胞增殖。牛原代成肌细胞在96孔板中培养,每个处理有8个独立的重复。37℃培养24 h后,每孔加入10μL CCK-8试剂4 h。然后使用全自动酶标仪（Molecular Devices,USA）在450 nm处测定所有样品的吸光度值。牛原代成肌细胞接种于60 mm细胞培养板（2×106个细胞/孔）中。转染24 h后,收集细胞,用PBS缓冲液洗涤,用1mL DNA染色液和10 μL渗透液重悬（Multisciences,Hangzhou,China）。然后在室温黑暗中孵育30分钟。流式细胞术（FACS Canto TM II,BD Biosciences,USA）测量细胞周期,每个处理组有3个独立的重复。为了研究circMYL1与miR-2400的结合位点,将HEK293T 细胞接种于 96 孔板中。然后,将 miR-2400 mimics、PCK-circMYL1 或 miR-2400 sensor 和 PCD2.1-circMYL1 与 Lipofectamine 2000 共转染到 HEK293T 细胞中。miR-2400 mimics 和 MYOG-WT 或 MYOG-MUT,miR-885 mimics 或 NTC,psiCHECK2-MyoD1-3’UTR-WT 或 psiCHECK2-MyoD1-3’UTR-MUT 也被共转染到细胞中。24 h后,用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗涤细胞,用100 μL被动裂解缓冲液（passive lysis buffer,PLB）收集细胞。荧光素酶活性检测采用MPPC发光分析仪（HAMAMATSU,北京,中国）和双荧光素酶（?）报告物（DLR）检测试剂盒（Promega,Madison,WI,USA）。萤火虫荧光素酶在每个孔内的活性归一化为Renilla发光。采用含1mmol/L PMSF（Solarbio,北京,中国）。然后在5×SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸10分钟。随后,用SDS-PAGE对蛋白进行分离,转移到0.2 μm聚偏氟乙烯膜（PVDF）上。然后在室温下用5%脱脂牛奶和Tris缓冲盐水孵育2小时,用Tween（TBST）堵塞PVDF膜。然后,将特异性的一抗在4℃过夜孵育,一抗包括anti-myod1（稀释 1:1000;ab16148;Abcam,England）,anti-MYOG（稀释 1:1000;bs-3550 r;Bioss,中国）,anti-myh2（稀释 1:1000;WL02785;万类生物,中国沈阳）,anti-CDK2（稀释 1:1000;WL02028;中国万类生物）,anti-pcna（稀释1:500;WL03069;万类生物,中国）,anti-CCNB1（稀释 1:1000;WL01760;中国万类生物）,anti-p21（稀释1:1000;WL0362;中国万雷生物）,anti-fstl1（稀释1:1000;ab223287;Abcam,England）,anti-CDC6(稀释 1:1000;bs-1390 r;anti-β-肌动蛋白（稀释 1:1500;WL01372;Wanleibio,中国）。PVDF 膜用 TBST 洗涤 5次,然后用抗兔IgG-HRP二抗（稀释1:1000;LK2001;Sungene生物技术,中国）处理,最后,利用ECL发光液（Solarbio,China）检测蛋白条带。牛原代细胞在24孔培养板中培养,诱导分化4天形成肌管。分化后的细胞用4%多聚甲醛固定30分钟,然后用PBS洗涤细胞,0.5%Triton X-100使细胞通透15分钟。然后用 1%牛血清白蛋白稀释myhc-抗体（1:250;GTX20015,GeneTex,USA）。细胞被洗净后,用二抗（抗小鼠IgG H&L,Alexa面粉594）1:500稀释,室温孵卵2小时。在室温下用DAPI染色15分钟。用荧光显微镜（DM5000B,德国）捕获图像。所有定量数据均以均数±SEM表示,用于统计分析。采用t检验方法分析组间差异的统计学意义。采用SPSS v20.0软件进行统计分析。P<0.05为有统计学意义,P<0.01为极显著。本研究旨在明确circMYL1调控牛肌生成的分子机制,并通过miR-2400相互作用揭示其调控机制。研究发现,circMYL1可以作为海绵吸附miR-2400激活MYOG基因表达,抑制牛原代成肌细胞的增殖并促进其分化。为了探究circMYL1在骨骼肌细胞增殖中的作用,通过转染circMYL1过表达载体和circMYL1干扰RNA（pCD2.1-circMYL1和si-circMYL1）到牛原代成肌细胞,进行过表达和干扰实验。转染48 h后用RT-qPCR检测 circMYL1 的相对表达量。此外,在转染 pCD2.1-circMYL1/NTC 或 si-circMYL1/si-NC 后,通过 RT-qPCR、Western blot、Cell cycle、CCK-8、EdU 检测牛原代成肌细胞的增殖过程。首先,利用RT-qPCR和Western blot检测了 circMYL1对增殖标志基因（PCNA、CyclinD1和CDK2）表达的影响,结果显示过表达circMYL1显著降低了这些基因在mRNA和蛋白水平的表达。然后,细胞周期分析显示过表达circMYL1减少了 S期细胞数量,增加了 G0/G1期细胞数量。EdU染色进一步证实上述结果。结果显示,处理组的EdU阳性细胞数少于对照组。CCK-8检测结果显示,circMYL1的增殖活力低于阴性对照。此外,用si-circMYL1转染牛原代成肌细胞,发现干扰circMYL1后,增殖标志基因（PCNA、CyclinD1和CDK2）在mRNA和蛋白水平上的表达增加。细胞周期分析显示si-circMYL1增加了 S期细胞数量,减少了 G0/G1期细胞数量。此外,与阴性对照组相比,circMYL1的下调显著增加了 EdU标记细胞的数量（P<0.05）。此外,CCK8结果表明,转染si-circMYL1比阴性对照具有更高的增殖活力。这些结果表明,circMYL1抑制牛原代成肌细胞的增殖。为了研究circMYL1在骨骼肌分化调控中的可能作用,用pCD2.1-circMYL1/NTC或si-circMYL1/si-NC转染牛原代成肌细胞分化4天。然后收集细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测分化标志基因MyoD、MYOG、MYH2的表达水平。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,过表达circMYL1增加了 MyoD、MYOG、MYH2的表达量。与si-NC组相比,circMYL1的下调降低了 MyoD、MYOG和MYH2 mRNA的表达水平。同样,Western blot分析显示,与对照组相比,过表达circMYL1增加了 MyoD、MYOG和MYH2的蛋白水平（P<0.001）,而与si-NC组相比,干扰circMYL1降低了 MyoD、MYOG和MYH2的蛋白水平。此外,免疫荧光实验的结果发现,cirMYL1过表达增强了肌管的形成。同时,分化后分化指数和融合指数均升高,而干扰circMYL1降低了分化指数和融合指数以及肌管的形成。综上所述,circMYL1可能促进牛成肌细胞的分化。为了筛选miRNAs与circMYL1结合的潜力,使用了双荧光素酶检测试验来确定circMYL1和miRNA之间潜在的互补位点。结果显示,miR-2400降低了 HEK293T细胞中 psiCHECK-2-circMYL1（PCK-circMYL1）的 Rluc 表达。此外,通过将两份miR-2400互补序列插入psiCHECK-2载体,生成了 miR-2400的sensor。结果显示,miR-2400显著降低了 HEK293T细胞中miR-2400 sensor的Rluc活性,另一方面,过表达circMYL1部分恢复了通过剂量依赖的方式结合miR-2400产生的Rluc活性降低。随后,在牛原代成肌细胞中进行了 RNA免疫沉淀（RIP）实验,以确认circMYL1和miR-2400之间的相互作用,RT-qPCR结果显示,与阴性对照（IgG）相比,Argonaute 2（Ago2）下拉样本中富集 miR-2400 和 circMYL1,表明 circMYL1 通过Ago2蛋白与miR-2400结合。此外,转染circMYL1可抑制牛原代成肌细胞中miR-2400 的相对表达水平。分析了牛原代成肌细胞在肌生成过程中 miR-2400 的表达水平,结果显示miR-2400在增殖过程中表达增加,在分化过程中表达减少。从这些结果来看,在肌形成过程中,miR-2400的表达水平与circMYL1的表达水平相反。综上所述,circMYL1可通过调控miR-2400表达水平调节牛原代成肌细胞的增殖和分化。为了探索miR-2400在成肌细胞增殖过程中的作用,牛成肌细胞密度达到40%转染 miR-2400 mimics、miR-2400 control 以及 pCD2.1-circMYL1/NTC 48 h。RT-qPCR 结果显示,转染miR-2400 mimic后,增殖标志基因（PCNA、CyclinD1、CDK2）在mRNA水平上的相对表达量增加。同样,Western blot分析显示,miR-2400过表达增加了 PCNA、CyclinD1和CDK2的蛋白表达水平。细胞周期分析显示,miR-2400 mimic增加了 S期细胞数量,降低了 G0/G1期细胞比例,说明miR-2400可能促进牛成肌细胞的增殖。此外,EdU和CCK-8结果显示过表达miR-2400促进细胞增殖。通过转染70%～80%密度的miR-2400 mimic或PCD2.1-circMYL1的牛原代成肌细胞,分析miR-2400在骨骼肌分化调控中的潜在作用。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,miR-2400 mimics 降低了 MyoD、和 MYH2 的 mRNA 表达水平。此外,Western blot分析显示,与对照组相比,miR-2400 mimics降低了 MyoD、MYOG和MYH2的蛋白水平。免疫荧光分析显示,miR-2400降低分化指数、融合指数和肌管形成。综上所述,这些结果证实了 miR-2400抑制牛原代成肌细胞的分化。2.miR-885通过靶向MyoD1来促进成肌细胞的增殖并抑制其分化实验结果还发现,miR-885通过直接靶向成肌细胞MyoD1的3’-UTR,可能在细胞发育和再生、增殖和分化中具有重要的调控作用。牛骨骼肌原代细胞转染miR-885 mimic,阴性对照（NTC）,首先检测miR-885 mimic的过表达效应。基于RT-qPCR的结果表明,miR-885 mimics处理的细胞中miR-885的表量比NTC组高200倍。多种实验方法,包括 RT-qPCR、Western blot、Cell cycle、CCK-8 以及 EdU,已被用于研究miR-885在成肌细胞增殖中的潜在功能。为了研究miR-885在细胞增殖中发挥的作用,当细胞融合达到40%时用miR-885 mimics和NTC转染成肌细胞并检测其标志基因,发现与阴性对照相比,miR-885过表达后PCNA、CDK2、CCNB1基因的表达量较高。通过Western blot分析,也证实了PCNA、CDK2和CCNB1标记基因在蛋白水平上的高表达。通过流式细胞术进一步评估了成肌细胞在G1/G0期、S期和G2期的细胞周期分布。结果发现miR-885过表达使G1期细胞数目减少,S细胞的数量增加。EdU实验进一步证实了上述结果。miR-885过表达后成肌细胞中EdU阳性细胞的数量更多。此外,CCK8实验结果发现,与NTC组相比,miR-885 mimic处理组在490 nm处显示出较高的细胞吸收率。结果还表明,miR-885抑制剂在mRNA和蛋白水平上显著降低了增殖标志基因PCNA、CDK2和CCNB1的表达。此外,流式细胞检测结果发现,miR-885的下调抑制了 S期细胞的分布,显著抑制了细胞增殖。此外,与阴性对照组相比,miR-885的下调显著减少了 EdU标记细胞的数量。CCK-8结果发现转染miR-885抑制剂的细胞增殖活力低于转染抑制剂阴性对照。通过将miR-885 mimics、阴性对照（NTC）、miR-885抑制剂或抑制物阴性对照（INC）引入牛肌原代细胞,检测了 miR-885在成肌分化过程中的功能。将牛肌原代细胞在生长培养基中以70%～80%的密度转染miR-885 mimics或抑制剂,然后将培养基改为分化培养基进行诱导。在分化第3天,收集细胞检测成肌细胞分化标志基因MyoD和MYOG的表达。miR-885的过表达下调MyoD和MYOG基因的mRNA水平,而miR-885的下调则增加了 MyoD和MYOG基因的mRNA表达。此外,免疫荧光结果显示,在miR-885-mimics组中,MyHC-阳性肌管的数量小于对照组。相反,miR-885抑制剂组MyHC阳性肌管数量高于对照组。综上所述,这些结果表明miR-885在牛肌原代细胞分化过程中起负调控作用。利用TargetScan Human 7.1和DAVID软件预测MyoD1基因可能是miR-885的靶基因之一,且其3’-UTR具有与miR-885种子序列互补的结合位点。已有研究表明MyoD1是一种肌原性转录因子,在肌肉分化过程中起着至关重要的作用。将MyoD13’-UTR的miR-885结合种子区克隆到psiCHECK-2载体的Renilla荧光素酶编码序列中。miR-885 mimics 或阴性对照（NTC）与 psiCHECK-2-MyoD1-3’-UTR-WT 或psiCHECK-2-MyoD1-3’-UTR-MUT共转染HEK-293T细胞。双荧光素酶结果显示,miR-885 mimic 和 psiCHECK-2-MyoD1-3’-UTR-WT 共转染成肌细胞时,过表达 miR-885显著降低了荧光素酶活性比值。而psiCHECK-2-MyoD1-3’-UTR-MUT试验组没有显著下降。结果显示,在牛肌原代细胞分化过程中,过表达miR-885显著降低了MyoD1 mRNA和蛋白水平的表达。相反,miR-885的下调显著增加了 MyoD1在mRNA和蛋白水平上的表达。结果表明,过表达miR-885抑制了牛肌原代细胞MyoD1 mRNA和蛋白的表达。综上所述,miR-885通过靶向MyoD1基因调控牛成肌细胞的增殖和分化。此前有研究表明MyoD1转录因子可激活和抑制多种骨骼肌基因。一些研究报道MyoD1诱导P21在体外表达。此外,干扰MyoD1降低了 C2C12细胞表达Cdc6基因的潜力。MyoD1通过抑制Fstl1基因的表达来刺激miR-206的转录。发现MyoD1下游基因的表达是通过改变MyoD1的表达来影响的。用miR-885 mimics、阴性对照（NTC）、miR-885抑制剂或抑制物阴性对照（INC）转染牛肌原代细胞,检测P21、Cdc6和Fstl1基因的表达水平。发现,miR-885 mimics处理组p21和Cdc6的mRNA表达显著降低,而miR-885抑制组p21和Cdc6的mRNA表达显著升高。同样,在miR-885 mimics处理的细胞中,p21和Cdc6蛋白水平显著降低,而在miR-885干扰后则显著增加。同样,miR-885 mimics处理的细胞中Fstl1蛋白水平显著升高,而miR-885抑制物处理的细胞中Fstl1蛋白水平显著降低。提示miR-885可能影响MyoD1的表达,从而改变MyoD1下游基因的表达。本研究的结果将有助于进一步理解miRNA-885在肌发生中的作用。综上,可以得出结论:（1）miR-2400是牛的一种特异性miRNA,MYOG基因是miR-2400的重要靶基因,miR-2400可以调控靶基因MYOG的表达水平,并在肌细胞增殖分化中发挥调控作用。（2）circMYL1在肌肉组织中高度表达。circMYL1序列中有一个miR-2400结合位点。它可以通过竞争性结合miR-2400下调肌细胞中miR-2400的表达水平,缓解抑制MYOG表达,从而抑制成肌细胞增殖,促进成肌细胞分化。（3）MyoD1基因是miR-885的直接靶基因,其机制研究发现miR-885通过转录后调控MyoD1。MiR-885正向调控牛原代成肌细胞增殖,抑制分化。