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研究背景和目的:牙周炎是影响口腔健康导致失牙的主要原因,传统的治疗方案仅能改善牙周环境难以修复牙周炎引起的牙槽骨缺损。牙周组织工程通过构建细胞和多种材料的复合体并移植于牙槽骨缺损处,起到重建牙周组织、治疗疾病的作用。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周膜中具有自我增殖与多向分化潜能的干细胞,运用于牙周组织工程可显著增强牙周组织的形成和修复能力。骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins-9,BMP9)是优秀的成骨生长因子,已证实其具有较好的促干细胞成骨分化的能力,但对其作用机制尚不明确。有学者提出BMP9的作用机制包含Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins,Smads)传递信号为主的BMPs-Smad经典通路,以及通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)传递信号的BMPs-MAPK非经典途径,其中BMPs-Smad经典通路已获得学术界普遍认可,但对于BMPs-MAPK途径尚处于探索和初级研究阶段。MAPK通路下游底物与骨生长发育并没有直接关系,但有研究报道部分MAPK家族成员参与BMPs促成骨分化,因此猜测MAPK是通过串话其他通路参与BMPs诱导成骨的过程。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)作为MAPK家族重要成员,尚没有在BMP9促进成骨分化的作用和机制中有研究报道。此前有学者证实JNK与Smad2/3蛋白可以发生相互作用,这为两条通路的串话提供了前提,但是目前为止,尚未有JNK通路和Smad2/3通路在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中是否发生串话以及如何发生串话的文献报道。为了明确JNK通路是否在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用,以及JNK通路是否串话Smad信号通路,如何进行串话等问题,本项课题将深入研究讨论。研究思路与方法:1.从牙周膜组织中通过改良组织块贴壁法获取离体细胞,通过CD146免疫磁珠分选获取PDLSCs,之后进行细胞表面标志物鉴定、组织来源鉴定、成骨分化和成脂分化能力鉴定。2.构建过表达Ad-BMP9载体,检测其对PDLSCs合适的感染剂量(multiplicities of infection,MOI)后诱导PDLSCs成骨分化,检测BMP9、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙蛋白(osteoclain,OCN)等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性等指标,分析BMP9促进PDLSCs成骨分化的能力。3.通过SP600125和Ad R-si-JNK抑制或干扰JNK通路,验证干扰效果后,检测Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标,判断JNK通路是否参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化。通过抑制或干扰JNK通路,检测Smad2/3和p-Samd2/3的蛋白表达,判断JNK通路是否与Smad通路有密切关系,最后通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测p-JNK是否与Smad2/3发生反应。综合分析后,判断JNK通路是否串话Smad通路并在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用。4.向裸鼠肌肉内移植过表达BMP9的PDLSCs,使用腺病毒干扰JNK通路,通过影像学和HE染色对比未干扰JNK通路裸鼠异位成骨状态,鉴定分析JNK通路对BMP9诱导PDLSCs体内成骨的影响。研究结果和结论:1.经磁珠分选所得的细胞同时表达CD146阳性和STRO-1阳性比例约占27.9%;免疫荧光染色显示角蛋白阴性、波形蛋白阳性,表示细胞为中胚层来源的间充质细胞,且无外胚层来源细胞的污染;茜素红S染色和油红O检测表明分选后细胞具有成骨和成脂的多向分化潜能。2.荧光表达显示Ad-BMP9感染PDLSCs的MOI值为30-60,感染之后BMP9基因蛋白明显增高,表明构建的腺病毒有效;此外Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白和ALP活性均较对照组明显增高,结果具有统计学意义,证明BMP9具有诱导PDLSCs成骨分化的作用。3.分别抑制或干扰JNK通路后,p-JNK蛋白表达下降,证实JNK通路受到影响;干扰之后Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标均有不同程度下降,结果具有统计学意义,表明JNK通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化;此外p-Smad的蛋白也随着JNK通路被干扰而表达下降,证实JNK通路与Smad通路关系密切,最后通过Co-IP检测证实p-JNK和Smad2/3存在相互作用,结果表明JNK通路是通过串话Smad通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化的过程。4.影像学结果显示,添加干扰JNK通路的BMP9诱导PDLSCs体内成骨模型,所形成的异位骨或骨样组织的体积和骨密度均小于未经干扰的裸鼠;HE染色显示干扰组成骨进程处于早期,并落后于未经干扰的组,结果与体外结论类似,这表明JNK通路是BMP9诱导PDLSCs体内成骨分化的重要途径,但不是唯一途径。