山楂叶是常用的中药之一,现代药理研究表明山楂叶及其制剂在心脑血管疾病方面具有很好的疗效。中药山楂系蔷薇科山楂属和苹果属几种植物成熟果实的通称。品种来源复杂,供药用的主要有蔷薇科山楂属的山楂Crataegus pinnatifida Bge.、山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br、野山楂Crataegus Sieb.et Zucc.、云南山楂Crataegus scabrifolia(Franch.)Rehd.(云山楂)等,以及苹果属的台湾林檎Malus doumeri(Bois)Chev、光萼林檎Species M.doumeri(Bois)Chev.(广山楂)等。2015版中国药典收载的山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶,商品名俗称北山楂叶。除了中国药典收载的山楂叶外,部分省份还习用云山楂叶和广山楂叶,广山楂叶在广西等地使用已久,并且被收录于1990版《广西中药材标准》。经查阅文献,北山楂叶与广山楂叶中均含有黄酮类和有机酸类成分,但其种类和含量有较大的差别。化学成分的不同会引起药理及临床疗效的差异。为了更合理的使用山楂叶,充分发挥其临床疗效,本实验对33批中国药典收载的山楂叶和8批产于广东、广西省的广山楂叶质量进行系统的比较分析。山楂叶的质量控制方法现多采用高效液相法(HPLC-DAD)对单个或多个成分进行含量测定以及指纹图谱研究。HPLC法存在着分离时间长,灵敏度低等不足,而超高效液相色谱法(UPLC)具有快速、灵敏、分离度高等优点。另外,液质联用(LC-MS)技术能够将液相色谱的高分离能力与质谱的强大结构测定功能相结合,在中药化学成分研究中有着广泛的应用,通过对质谱数据的采集和分析,可以对含量低、分离效果差及紫外吸收弱等不适宜用HPLC-DAD进行测定的成分进行定性、定量检测。鉴于此,本研究拟采用UPLC法代替HPLC法对北山楂叶和广山楂叶进行指纹图谱比较研究,通过主成分和聚类分析分别建立北山楂叶和广山楂叶的指纹图谱共有模式,并完成5种已知成分的同步测定;同时采用LC-MS技术结合对照品和文献对山楂叶中部分成分进行化学成分识别;定量方面采用LC-MS法,采用多反应监测模式(MRM)增加对含量低、分离效果差等,不适宜用UPLC-DAD检测的表儿茶素、山楂叶苷A和芦丁的含量测定,完成北山楂叶和广山楂叶中8种成分的含量测定。综上,本研究从定性、化学成分、定量等方面对北山楂叶和广山楂叶进行系统比较分析,从而阐明不同产地山楂叶的异同,为临床上合理用药提供理论依据。第一部分不同产地北山楂叶与广山楂叶UPLC指纹图谱研究及多组分含量测定目的:采用UPLC法分别建立北山楂叶和广山楂叶UPLC指纹图谱共有模式,同时对各产地山楂叶中所共有的绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷5种成分进行含量测定,从定性和定量方面对北山楂叶和广山楂叶进行比较分析。方法:采用UPLC法,采用Waters CORTECS UPLC C18色谱柱(3.0 mm×100mm,1.6μm),以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相,梯度洗脱,T:0~4~7~14~16~25~28~30 min,A(12%~12%~17%~17%~25%~40%~80%~80%),B(88%~88%~83%~83%~75%~60%~20%~20%),流速0.2 m L·min-1,检测波长320 nm,柱温30℃,进样量3μL,分别建立北山楂叶和广山楂叶UPLC指纹图谱,标定指纹共有峰,通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱相似度评价,然后,以共有峰的峰面积为变量,运用SPSS数据统计软件通过聚类分析、主成分分析,分别建立北山楂叶与广山楂叶指纹图谱共有模式。相同条件下,测定不同产地北山楂叶与广山楂叶中5种成分的含量。结果:1建立33批北山楂叶指纹图谱,标定出8个共有峰,33批样品与对照图谱的相似度为:0.171~0.985。2通过系统聚类分析和主成分分析,33批北山楂叶样品被聚为3类:S2~S21、S23~S31、S33为第Ⅰ类,S1、S32为第Ⅱ类,S22为第Ⅲ类。3剔除了峰数目和峰面积相差较大的第Ⅱ、Ⅲ类3批样品,选取第Ⅰ类S2~S21、S23~S31、S33共30批样品建立北山楂叶指纹图谱共有模式,标定10个共有峰,通过相似度评价,30批样品与对照图谱的相似度为0.835~0.989。4建立8批广山楂叶指纹图谱,标定出20个共有峰,通过相似度评价,8批样品与对照图谱的相似度为:0.923~0.977。5相同色谱条件下,采用外标法,测定出33批北山楂叶和8批广山楂叶样品中绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷的含量。结论:通过聚类和主成分分析后所建立的30批北山楂叶指纹图谱共有模式和8批广山楂叶指纹图谱准确、可靠,同时测定了5种成分的含量。从UPLC指纹图谱和多组分定量方面对北山楂叶和广山楂叶进行了分析比较。第二部分山楂叶LC-MS化学成分分析目的:采用LC-MS技术结合已知对照品和参考文献,推断部分有机酸,黄酮类的裂解,对山楂叶中化学成分进行结构分析,为山楂叶研究提供物质基础。方法:色谱条件:同第一部分的色谱条件;质谱条件:采用Triple TOFTM 5600质谱检测器,运用ESI源,分别在正、负离子模式下确定质谱参数为:质量范围100-1000 m/z;源温度600℃;雾化气50 psi;辅助气50 psi;气帘气35 psi;源内电压5500 V(正离子模式)、-4500 V(负离子模式)。结果:通过质谱碎片信息结合对照品和文献报道数据对山楂叶中部分成分进行结构分析,采用Triple TOFTM 5600质谱检测器鉴定了山楂叶中11个成分。结论:通过高分辨质谱对山楂叶部分化学成分进行鉴别,为山楂叶研究提供物质基础。第三部分基于HPLC-MS的不同产地北山楂叶与广山楂叶多组分含量测定目的:采用LC-MS技术增加含量低、分离度差等的表儿茶素、山楂叶苷A和芦丁的检测,同时对绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷进行含量测定,增加北山楂叶与广山楂叶定量研究指标。方法:液相条件:采用HPLC,运用Agilent Poroshell 120 SB-C18(2.1mm×100 mm,2.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱:T:0~10~25~35~40~45~55 min,A(90%~88%~80%~80%~40%~20%~10%),B(10%~18%~20%~20%~60%~80%~90%),检测波长320nm;流速0.15 m L·min-1;柱温30℃;进样量1μL。质谱条件:采用Agilent 6310质谱检测器,ESI源,MRM,负离子模式,质谱参数为:质量范围100-700 m/z;源温度350℃;氮气压力20 psi;干燥气流速10 L·min-1;电压3750 V。结果:通过采用LC-MS方法,结合MRM模式,共测定33批北山楂叶和8批广山楂叶中表儿茶素、绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、山楂叶苷A、芦丁、金丝桃苷8种成分的含量。结论:本研究增加了北山楂叶与广山楂叶定量检测指标,所建立的LC-MS法测定北山楂叶与广山楂叶中8种成分的含量准确、可靠,从定量方面为评价不同产地北山楂叶质与广山楂叶质量提供理论依据。