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研究背景：AD是一种中枢胆碱能神经系统退行性变引起的以进行性痴呆为主要临床特征的老年性疾病。以Aβ为主要成分的老年斑的形成和胆碱能神经元的减少和缺失AD的两个主要病理变化，它们是导致AD病人认知功能减退的两大主要原因，目前胆碱能神经元缺失和减少的原因和机制尚不清楚，其与Aβ沉积之间的确切关系仍是令人困惑的一个问题。基底前脑富含胆碱能神经元，而神经生长因子(NGF)是维持胆碱能神经元表型、功能、生长和存活的重要因素，但其发挥作用必须通过与胆碱能神经元表面的受体结合才能起作用。70-90％的基底前脑胆碱能神经元表达高亲和力的NGF受体(TrkA)，最近的研究发现AD病人基底前脑TrkA表达降低，其可能与胆碱能神经元功能的改变密切相关，那么研究作为AD发病的重要始动因素的Aβ对胆碱能神经元表面TrkA的影响就非常关键和必要。目前国内外尚未见有报道。尼古丁是一种胆碱能激动剂，近几年观察发现尼古丁可以逆转内侧隔核毁损大鼠的空间记忆缺陷，改善老年猴子记忆及对视觉刺激的敏感性。使PC12细胞株上的TrkA的表达增加，因而尼古丁可能通过增加胆碱能神经元表面的TrkA的表达对神经元起到一定的营养作用。尼古丁是否对Aβ所致的神经元的损伤有逆转作用尚不清楚。本研究拟在体外和体内两方面观察Aβ对大鼠基底前脑胆碱能神经元的TrkA表达变化进行观察，同时对尼古丁的干预作用进行评价。 材料与方法：一、体外实验：用神经细胞原代培养技术培养基底前脑胆碱能神经元并进行鉴定，结合MTT实验检测细胞活力，显微技术观察细胞形态，RT-PCR技术观察神经元TrkAmRNA的表达情况，免疫细胞化学技术观察TrkA蛋白的表达情况，进行如下实验：(1)用4种不同终浓度(1μM、5μM、10μM、25μM)的Aβ(25-35)对原代培养的胆碱能神经元进行干预，观察神经元形态、活力、TrkA表达的变化情况；(2)用5种不同终浓度的尼古丁(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)对原代培养胆碱能神经元进行干预，观察细胞的形态变化、MTT实验观察细胞的活力、提取细胞总RNA行RT-PCR观察神经元TrkAmRNA表达的变化，细胞免疫组化观察TrkA表达的变化：用10μM终浓度的尼古丁以不同的时间(分别为8h、24h、48h)进行干预，观察不同时间干预下上述指标的变化。(3)在上述两个研究的基础上选择合适的Aβ(10μM)和尼古丁(10μM)浓度同时对原代培养的胆碱能神经元进行干预，观察神经元的变化情况，从而对Aβ的毒复旦大学博士学位论文性作用和尼古丁的干预作用进行评价。二、在体内实验中对上述实验结果进行重复和验证，并加以扩展:(l)运用大鼠立体定向技术制作Ap损伤大鼠基底前脑胆碱能神经元的动物模型，并用Morris水迷宫方法进行大鼠学习和记忆能力的评价，实验动物分为两周和4周组，每组40只，每个时间阶段的大鼠又分为5个组，分别为空白对照组、机械损伤组、人工脑脊液注射组、Ap注射组、尼古丁干预组，分别于大鼠双侧基底前脑区注射Ap(1一40)，每侧10陀/1川，于相应的时间阶段后进行学习和记忆能力的训练和评价。(2)运用Rl;pCR、免疫组化技术、免疫印迹技术观察基底前脑组织NGF及TrkA表达的变化;(3)进一步观察与基底前脑区有密切关联的海马和前额叶区域NGF及TrkA表达的变化。(4)同时用尼古丁腹腔注射进行干预观察上述行为学和指标的变化。 结果:体内实验:(1)1林M浓度的Ap(25一35)对原代培养的神经元形态和细胞活力无明显的影响，但5林M、10林M、25“M终浓度可以引起细胞突起长度减小、突起数量减少，细胞活力下降，1林M浓度Ap(25一35)引起神经元肠kA表达的增强，而其它浓度的A汉25一35)引起TrkA表达的下降。(2)在0.01一10林M浓度范围内尼古丁呈剂量依赖性的增加神经元TrkA的表达，100林M浓度的尼古丁则引起肠kA表达的下降，前四个浓度可以剂量依赖性的增加原代培养的神经元细胞突起数量、平均突起长度和最长突起长度，增加MTT法测得的oD值，100林M终浓度尼古丁则产生相反的作用;用10林M终浓度的尼古丁以不同的时间(分别为sh、24h、48h)进行干预，上述几个指标随培养时间的延长而增加。(3)以10哪浓度的A侧25一35)对培养7天的胆碱能神经元进行干预，48h后观察细胞形态，结果与前面一致，引起细胞的突起数量、平均突起长度、最长突起长度的减少和缩短，MTT法测得的OD值下降，免疫组化和Rl’- PCR发现肠kA表达减少;当以10林M浓度的尼古丁与上述同样浓度的Ap(25一35)共同对培养的神经元进行干预时，则使细胞突起数量、平均突起长度、最长突起长度的减少和缩短的量减少，MTT法测得的OD值下降量减少，肠kA表达增多，与Ap(25一35)组比较，有统计学差异(P<0.05)。体内实验:1、基底前脑注射凝集状态的Ap(1一40)在2周时可以造成大鼠学习一记忆损伤的模型，Motris水迷宫实验对此模型进行评价发现(l)大鼠平均寻找平台的潜伏期;(2)学习情况;(3)在第三象限和平台区停留的时间百分比:(4)寻找平台的方式与对照组相比均有差异(P<0.05)。4周组动物上述参数与对照组基本上没有差异。2、基底前脑注射凝集状态的Ap(1一40)在2周组的大鼠造成学习记忆损伤的同时，引起基底前脑C】IAT?