论文部分内容阅读
背景：大量的研究认为：活性氧类物(ROS)，如超氧阴离子和过氧化氢等)参与多种病理生理过程，包括内皮舒张功能减退，系统性高血压，细胞凋亡和炎症反应以及触发细胞内信号转导途径，参与许多疾病包括心血管疾病、神经变性、炎性疾病及感染：ROS在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)参与的病理生理活动中起重要的作用；解偶联蛋白2(UCP2)属线粒体阴离子携带者-大家族的成员之一，研究表明UCP2可以通过使氧化磷酸化与ATP合成解偶联而降低线粒体内膜电势，从而抑制ROS的生成。
目的：观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮细胞线粒体膜电位和活性氧的影响，探讨解偶联蛋白2(UCP2)在该途径中的作用。
方法：实验共分三部分。
(1)为了观察AngⅡ对内皮细胞活性氧生成的影响，按干预浓度分为四组：对照组(DMEM培养基)，AngⅡ0.1μmol/L组，AngⅡ1μmol/L组，AngⅡ10μmol/L组分别与HUVEC(原代培养的人脐静脉内皮细胞)共同孵育24小时，RT-PCR法定量UCP2mRNA表达，DCFH-DA检测线粒体活性氧(流式细胞仪法)，罗丹明123检测线粒体膜电位(流式细胞仪法)。
(2)为了观察UCP2对内皮细胞活性氧的影响，首先通过UCP2反义寡核苷酸降低UCP2表达，实验分组：对照组(DMEM培养基)，UCP2反义寡核苷酸(浓度10μmol/L)组，UCP2错义寡核苷酸(浓度10μmol/L)组，然后用外源性解偶联剂增加内皮细胞解偶联活性，实验分组：对照组(DMEM培养基)，AngⅡ1μmol/L组，CLCCP(100μmol/L)+AngⅡ1μmol/L组，助溶剂DMSO100μumol/L+AngⅡ1μmol/L组，分别与HUVEC共培养24小时，DCFH-DA检测线粒体活性氧，罗丹明123检测线粒体膜电位。
(3)观察氧化剂对UCP2的影响，实验分组：对照组(DMEM培养基)，H2O2100μmol/L组，H2O250μmol/L组与HUVECs共培养24小时，RT-PCR法定量UCP2mRNA表达。
结果：用10μmol/L，1μmol/L，0.1μmol/L的AngⅡ处理HUVEC24小时后:
1)流式细胞仪测线粒体膜电位(罗丹明123染色)的平均荧光强度分别为418.1±5.8，354.1±4.2，267.6±10.6。流式细胞仪测活性氧(DCFH-DA法)的平均荧光强度是365.3±5.2，258.2±4.8，188.6±12.6。
2)UCP2mRNA表达(灰度值)分别是0.450±0.024，0.436±0.018，0.381±0.020，1μmol/L组比0.1μmol/L组表达增加极显著,10μmol/L组比1μmol/L组表达增加显著，即UCP2随AngⅡ的浓度升高而表达增加；用UCP2反义寡核苷酸(浓度10微摩尔/升)与HUVEC共培养24小时后，与对照组相比，活性氧升高83％，线粒体膜电位升高64％，CLCCP(浓度100微摩尔/升)与HUVEC共培养24小时后，与对照组相比，活性氧下降26％，线粒体膜电位下降28％。此外用浓度为100微摩尔/升和50微摩尔/升的H2O2干预HUVECs24小时，UCP2mRNA表达为0.412±0.026和0.393±0.018，50μmol/L儿组比对照组表达增加极显著，100gmo儿组比50μmol/L组表达增加显著，即UCP2随H202的浓度升高而表达增加。
结论：AngⅡ增加线粒体活性氧的产生，上调UCP2的表达；降低UCP2的表达使活性氧生成增加，增加线粒体解偶联活性(CLCCP)使线粒体活性氧生成减少，提示AngⅡ可能通过影响UCP2的表达从而影响线粒体活性氧的生成，也即UCP2具有抗氧化作用，通过提高解偶联蛋白2的表达从而减轻氧化应激可能是细胞抗氧化的重要机制。