辣椒是重要的经济作物,现在世界各国普遍栽培,而低温等一系列非生物胁迫是限制植物生长及地理分布的重要因子。辣椒对低温敏感,低于12℃生长缓慢,这给辣椒生产带来严重损失。揭示辣椒的抗寒机理是进行抗性育种的基础工作。因此,本试验克隆了低温逆境相关基因CaDHN1,分析其在低温等非生物胁迫以及相关信号分子的表达模式,并通过VIGS技术和遗传转化技术探究CaDHN1在低温等逆境胁迫中的功能。对辣椒DHN家族基因进行了生物信息学及其表达特性的分析,旨在明确脱水素基因在辣椒抗寒等抗逆中的作用。主要研究结果如下:1.利用本实验室前期构建的抑制消减杂交文库(SSH),从中获得一个262bp与脱水素蛋白高度同源的EST,克隆其全长,命名为CaDHN1。GenBank登录号为No.JX402924,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸。2.植物组织特异性表达分析,CaDHN1的表达量在果实中最高,而在根中非常低。低温、盐和渗透胁迫均诱导CaDHN1基因的表达,植物激素SA也可诱导其表达。然而喷施外源ABA以及金属胁迫后其表达均没有显著性的改变。利用VIGS技术沉默CaDHN1基因,低温胁迫处理,相对于对照植株,CaDHN1沉默植株出现了更加严重的萎焉,其丙二醛含量和电导率显著性的增加,而叶绿素含量出现了显著性的下降。辣椒叶圆片分别用盐和甘露醇胁迫处理3 d后,相对于对照植株,NaCl和甘露醇处理的CaDHN1沉默植株的叶圆片黄色加重,有的甚至变黑,而叶绿素水平显著性的减少。我们检测了胁迫相关基因(KIN1,Mn-SOD和POD)的表达。结果表明低温诱导了KIN1,Mn-SOD和POD基因在对照植株和CaDHN1沉默植株中的表达。但是它们在CaDHN1的沉默植株中的表达量明显的低于对照植株。CaDHN1基因的沉默可能降低了辣椒的抗逆性。将CaDHN1基因转化到拟南芥中,使其超表达,T3代转基因拟南芥纯系植株进行低温和盐胁迫试验。研究发现:相对于野生型拟南芥,CaDHN1超量表达的拟南芥低温处理后,其存活率明显提高;盐胁迫处理后,转基因植株长势明显较好。在垂直板上盐胁迫处理发现野生型植株的须根数和鲜重显著性的低于转基因植株。上述结果表明CaDHN1基因的表达与植株的抗冷性与耐盐性之间存在着正相关的关系。3.利用The Hidden Markov(HMM)(v3.0)软件,采用脱水素保守氨基酸序列(Pfam:PF00257)在辣椒基因组(PGP)(http://pepppergenome.snu.ac.kr/)和(http://pepper sequence.genomics.cn/page/species/index.jsp)蛋白数据库中检索,共7个辣椒DHN候选基因被识别。其中4个定位在2号染色体上;1个定位在4号染色体上;2个定位在8号染色体上。基于Y-,S-和K-模板的数量以及次序,辣椒的7个脱水素被分为YSK2-,Y3SK2-和SK3-型蛋白。采用辣椒、拟南芥、水稻、大麦和番茄蛋白构造一个无根系统发育树,结果表明DHNs被分为五组:YnSKn-,SKn-,Kn-,YK-和KS-型蛋白质,辣椒只有SKn和YnSKn两种类型。组织特异性表达显示:7个DHNs在所有组织中表达,可能参与了辣椒的生长和发育。基因表达谱显示:大多数CaDHN基因能够被各种非生物胁迫(低温、盐和甘露醇)和信号分子(ABA、SA和MeJA)诱导。