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癌症是威胁人类健康的重大疾病,最新发布的全球癌症统计报告显示,2018年,全球范围内的癌症新发及死亡病例分别高达1810万、960万。目前的肿瘤治疗中,化疗是主要手段之一;而相对于有机合成小分子,天然化合物具有来源广泛、价格低廉、毒副作用低的优势,并且具有调控多个关键信号通路而抑制肿瘤的潜力。因此,筛选具有抗肿瘤活性的天然化合物并深度探索潜在的抗肿瘤机理,可为推进它们的临床应用及其它天然化合物的开发利用提供依据。肿瘤中,抑癌基因p53高频突变,且突变不仅造成抑癌功能的分离、丧失,更获得驱动肿瘤恶性进展的特性,而由于p53突变所造成的构象改变是微小且可逆的,这使得通过天然化合物重激活mutp53,进而抑制mutp53肿瘤具有可行性。黄杨生物碱是黄杨属植物中活性成分,具有治疗心脑血管、脂肪肝等疾病的功效,但在抗肿瘤方面研究较少。我们前期的研究发现,提取自小叶黄杨中的三萜类黄杨生物碱KBA01,具有抑制肿瘤细胞增殖的能力,并且KBA01在降解mutp53的同时,wtp53及其下游基因PUMA、p21呈现明显上调趋势,这提示了KBA01可能是一个具有mutp53重激活功能的天然抗肿瘤化合物。基于此,我们进一步验证KBA01的mutp53重激活功能并探究潜在的作用机理。本课题研究中,我们首先探究了KBA01对于p53R273H构象的影响。采用PAb1620抗体（识别野生型p53）、PAb240抗体（识别突变型p53）进行免疫沉淀实验,发现KBA01处理后,HT29(p53R273H)细胞中mutp53表达下调,wtp53的表达明显上升,说明KBA01可以恢复p53R273H的野生型构象。由于p53的DNA结合活性及转录活性与其构象密切相关,我们探究了KBA01恢复p53R273H的野生型构象后,是否进一步恢复p53R273H的DNA结合活性。通过凝胶阻滞实验,发现KBA01处理后,HT29(p53R273H)、MDA-MB-231(p53R280K)细胞中与p53特异性结合的DNA量增多,说明KBA01可以恢复p53R273H、p53R280K的DNA结合活性。接着我们探究了KBA01是否进一步恢复p53R273H、p53R280K的转录激活能力。通过将PUMA启动子荧光素酶报告基因载体构建至H1299-p53R175H,H1299-p53R273H细胞中,发现KBA01明显增加了H1299-p53R273H细胞中的荧光酶的表达量;同时,通过染色质免疫共沉淀检测,发现KBA01处理后,HT29(p53R273H)、H1299(p53R273H)、MDA-MB-231(p53R280K)细胞中p53与PUMA启动子结合增强;此外,KAB01可上调HT29(p53R273H)细胞中PUMA、BAX等p53靶基因的蛋白水平,说明KBA01可以恢复p53R273H、p53R280K的转录活性。由于MDM2的结合以及p53 Lys382位点的乙酰化程度降低均会使p53稳定性下降,我们进一步探究了KBA01是否可以通过调控MDM2-p53蛋白互作及Acetyl p53（Lys382）的水平影响mutp53、wtp53的稳定性。发现KBA01处理后,HT29(p53R273H)细胞中MDM2-mutp53互作明显增强,MDM2-wtp53互作呈现一定的减弱趋势;Acetyl-wtp53（Lys382）表达上调,Acetyl-mutp53（Lys382）显著下降,说明KBA01可能通过调控MDM2-p53蛋白互作以及Acetyl-p53（Lys382）的水平稳定wtp53和降解mutp53。另外,我们进一步探究了KBA01上调p53靶基因是否由mutp53重激活引起。经过RNA干扰及转录抑制剂PFT-α抑制HT29(p53R273H)细胞中p53后,发现KBA01上调p53靶基因的现象明显受到逆转,说明KBA01通过重激活mutp53而上调p53靶基因。同时,通过免疫共沉淀、实时荧光定量PCR发现KBA01可以打破HT29(p53R273H)细胞中mutp53与TAp63/TAp73蛋白互作,并使TAp63、TAp73转录激活靶基因JAG1后,通过si RNA敲降TAp63、TAp73,KBA01对于HT29细胞中p53靶基因的调控未发生改变,说明TAp63、TAp73与KBA01上调p53靶基因无关。另一方面,我们探究了KBA01是否可以诱导氧化应激进而抑制肿瘤,发现KBA01处理后,SK-BR-3(p53R175H)、HT29(p53R273H)等肿瘤细胞中的ROS上升,说明KBA01可以诱导氧化应激。此外,由于热休克蛋白家族可以驱动错叠蛋白重折叠,我们探究了该家族对KBA01调控mutp53的影响。发现Hsp40、Hsp70、Hsp90抑制后,KBA01重激活mutp53现象并未改变,但mutp53的降解程度受到影响,说明热休克蛋白与KBA01降解mutp53有关。同时,我们也探究了KBA01是否可以影响Hsp90的伴侣活性,发现KBA01可以通过下调Acetyl-Hsp90（Lys294）而增强HT29(p53R273H)细胞中Hsp90的伴侣活性。另外,也探究了KBA01对HT29(p53R273H)细胞中热休克应答的影响,发现KBA01处理后,mutp53与Phospho-HSF1（Ser326）的蛋白互作减弱,Hsp70、Hsp90等HSF1靶基因m RNA水平下调,说明KBA01可以通过打破mutp53与Phospho-HSF1（Ser326）的互作而降低HSF1介导的热休克应答。另外,我们通过转录组测序探究了与KBA01肿瘤抑制功能相关的信号通路,发现KBA01处理后,HT29(p53R273H)细胞中p53、凋亡等信号通路明显上调;而DNA修复、周期等通路显著下调,说明了KBA01确实可以通过上调p53信号通路抑制肿瘤,并且可能与周期阻滞、凋亡诱导、DNA修复缺陷有一定联系。综上所述,我们研究发现KBA01可以恢复DNA结合突变p53R273H和p53R280K的野生型构象和DNA结合活性、转录激活功能,并且可能通过调控MDM2-p53蛋白互作以及Acetyl-p53（Lys382）的水平稳定wtp53和降解mutp53。转录组测序的结果验证了,KBA01确实可以上调HT29中的p53信号通路,并且可能通过诱导凋亡、周期阻滞等。此课题为开发KBA01在突变p53的抗肿瘤作用具有一定的指导意义。