【摘 要】
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大肠杆菌Rec A的同源物Radiation sensitive 51（RAD51）蛋白,最早在酿酒酵母中发现,是同源重组的中心重组酶,在减数分裂与有丝分裂中均起作用。RAD51具有依赖于DNA的ATP酶活性,可催化DNA链交换,对于DNA损伤修复、同源重组和基因组稳定性的维持非常重要。当前,全球气候变暖对植物的生殖发育影响极大,已成为作物减产的主要原因之一,提高植物高温胁迫下DNA损伤修复的能力
【基金项目】
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河南省高校科技创新人才计划项目（19HASTIT014）；
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大肠杆菌Rec A的同源物Radiation sensitive 51（RAD51）蛋白,最早在酿酒酵母中发现,是同源重组的中心重组酶,在减数分裂与有丝分裂中均起作用。RAD51具有依赖于DNA的ATP酶活性,可催化DNA链交换,对于DNA损伤修复、同源重组和基因组稳定性的维持非常重要。当前,全球气候变暖对植物的生殖发育影响极大,已成为作物减产的主要原因之一,提高植物高温胁迫下DNA损伤修复的能力显得尤为重要。经生物信息学分析预测Br RAD51D可能参与体细胞DNA重组、损伤修复等生物学过程。本研究旨在通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除白菜型油菜Br RAD51D基因,对比其与野生型白菜型油菜在高温胁迫下的差异,以进一步探究其高温胁迫下Br RAD51D基因参与基因组稳定性维持的机制。本研究所取得的主要结果如下:1.创制白菜型油菜Br RAD51D-Cas9植株,敲除Br RAD51D基因后发现突变体植株的生殖生长明显受到影响,荚果变短且干瘪,内部基本没有种子。在野生型植株授粉后仍无法正常结实,说明突变体雄性与雌性生育力均有异常。Br RAD51D-Cas9植株花朵与花瓣略小于野生型植株,花药正常开裂散粉,但经亚历山大染色后发现突变体花粉育性较低,且存在大量形态异常、塌陷、畸形的花粉粒,其内部呈明显空腔化。花粉管体外萌发及伸长实验结果发现Br RAD51DCas9植株花粉管基本无法正常萌发及伸长,暗示其花粉发育可能存在某种异常。2.Br RAD51D-Cas9植株营养生长稍慢于野生型植株,但未发现明显异常（不排除生长环境的影响）。对突变体植株花粉发育过程进行观察,发现Br RAD51D-Cas9植株四分孢子时期存在异常的二分孢子,暗示Br RAD51D-Cas9植株可能在减数分裂时期就存在某种异常。此外,单核靠边期小孢子的细胞核存在过于松散的异常形态,在三核期可观察到大量发育停滞于单核期的孢子,这些异常的孢子不断降解最终形成空壳花粉粒。3.DNA的完整性与稳定性是种子萌发的关键。种子萌发实验发现Br RAD51D-Cas9种子萌发明显滞后,萌发率低于野生型种子,推测可能是由于无法及时修复种子萌发过程中累积的DNA损伤致使种子活力下降、萌发迟滞。博来霉素是一种DNA双链断裂诱导剂,可以用于评估Br RAD51D在体细胞双链断裂修复中是否具有作用。结果发现Br RAD51D-Cas9幼苗对博来霉素过敏。生长于含有50 mg/ml博来霉素的1/2 MS培养基上的Br RAD51D-Cas9幼苗,叶片数目明显少于对照野生型幼苗,根长变短,幼苗生长发育受到明显影响,我们推测Br RAD51D参与体细胞DNA损伤修复,对基因组稳定性的维持起正向调控作用。4.种子是研究环境压力对基因组完整性影响的良好模型。对Br RAD51DCas9植株与野生型种子进行37℃高温胁迫,以比较两者去除损伤的能力。进行TTC染色实验以检测种子活力,22°C正常条件萌发的Br RAD51D-Cas9种子,其种子活力已明显低于野生型植株。在37°C高温胁迫处理后,Br RAD51D-Cas9种子基本完全失去种子活力。对萌发种子的NBT染色以检测其活性氧水平,发现37°C高温胁迫处理的Br RAD51D-Cas9种子ROS水平远高于对照组。ROS的积累会导致氧化损伤加剧,进而对种子萌发产生负面影响,使其萌发严重滞后。以上结果共同表明Br RAD51D正向参与高温胁迫响应,在维持基因组稳定性及DNA损伤修复中发挥重要作用。5.此外,本研究对白菜型油菜RAD51基因进行了鉴定,发现其在白菜型油菜中保留两个拷贝:Bra006580和Bra002334,根据两拷贝在染色体上的位置将其分别命名为Br RAD51-A03（ID:Bra006580）、Br RAD51-A10（ID:Bra002334）,全长克隆发现两拷贝序列一致性高达93.66%,在各组织中均有表达,但不确定是否存在一定的功能冗余。生物信息学分析发现两者功能保守,极有可能参与逆境胁迫下基因组稳定性的维持。创制OE-Br RAD51-A03植株以进一步研究Br RAD51基因与旁系同源基因Br RAD51D是否存在相互作用,为后续基因组稳定性信号通路及不同植物中重组修复途径研究奠定基础。目前,RAD51直系同源基因已在多物种中得到了分离,但对五种RAD51旁系同源物的了解仍不丰富。对Br RAD51D基因高温胁迫下的功能研究有助于增进植物维持基因组稳定性的方式的理解。本研究创制Br RAD51D基因敲除植株,实验发现Br RAD51D基因的敲除对于植物的生殖生长存在负面影响,花粉育性明显下降,且由于在高温胁迫下种子萌发所受到的DNA损伤无法及时高效的进行修复,从而造成基因组不稳定性增加。以上结果暗示了Br RAD51D基因可能正向调控高温胁迫下白菜型油菜的基因组稳定性。
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