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背景和目的:上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)是一种分化完全的上皮细胞丢失其原有的表型而转变为间质细胞的一种特殊的生理病理过程,受多种细胞因子、生长因子和激素的调节,其分子机制尚不明确。研究发现,肾小管上皮细胞发生EMT在肾脏纤维化的发展中起着重要作用,可能是肾间质纤维化(RIF)发生发展的重要机制。RIF是多种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同途径。转化生长因子β1(tansforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)是目前发现的最强的促纤维化因子,能够诱导胚胎发育、组织纤维化和肿瘤的发生中的EMT。肾小管上皮细胞转分化(renaltubularepithelialcelltransdifferentiation,TEMT)是一个可逆的有序的发生过程,TGF-β1诱导的TEMT最早改变就是抑制E-cadherin表达,E-cadherin的降低或不表达已成为细胞转分化的标志。因此,EMT以细胞和分子变化为特征,包括细胞间黏连和细胞极性的消失涉及黏着连接、紧密连接及细胞桥粒;上皮细胞角蛋白的下调;间质蛋白的上调如波形蛋白(VIM),在某些情况下还有平滑肌肌动蛋白(ACTA2);为形成纺锤状细胞形态的细胞骨架重构;涉及动态的肌动蛋白微丝的细胞运动和侵袭能力的增加;抗凋亡能力的增加。为了开展EMT发生的分子机制研究,探讨TGF-β1在人肾小管上皮细胞中促转分化的作用,拟建立基于肾小管上皮细胞-间质细胞转分化(TEMT)细胞模型。方法:1.根据GenBank数据库提供的基因序列,使用在线Primer-BLAST引物设计软件设计引物。采用RT-PCR方法检测E-cadherin的表达变化,优化TGF-β1作用浓度和作用时间。2.将实验分为正常对照组和TGF-β1处理组,利用TGF-β1(10ng/ml)处理实验组人肾小管上皮细胞(HK-2)24h,倒置显微镜下观察细胞形态。3.RealtimeRT-PCR、Westernblot和细胞免疫荧光检测检测EMT相关的分子标记。4.划痕实验和Transwellassay检测细胞迁移及侵袭能力。结果:1.成功设计PCR引物,根据E-cadherin基因表达,优化后得到TEMT中最佳时间点和浓度为TGF-β1(10ng/ml,24h)。2.构建TGF-β1诱导的EMT体外细胞培养模型,倒置显微镜下观察细胞形态:正常对照组细胞呈鹅卵石样形态;TGF-β1(10ng/ml)处理后细胞呈细长状,细胞间紧密连接降低。3.RealtimeRT-PCR检测:TGF-β1处理组E-cadherin的表达水平降低,β-catenin的表达上调。Westernblot和免疫荧光检测:TGF-β1处理组E-cadherin表达减低,Vimentin表达增强。4.划痕和Transwellassay法检测:TGF-β1处理组细胞的迁移及侵袭能力明显增强。结论:1.E-cadherin、Vimentin和β-catenin、细胞迁移及侵袭能力是细胞转分化的分子标志和特征。2.验证了TGF-β1在肾小管上皮细胞转分化中作为一个重要的诱导剂。3.TGF-β1(10ng/ml,24h)诱导的EMT体外细胞模型成功建立。