论文部分内容阅读
传统的正向遗传筛选主要包括辐射诱变,化学诱变和DNA插入诱变等基因突变方法。这几种诱变方法所产生的绝大多数突变会让基因丧失全部或部分功能,极少情况下产生功能获得性突变。正向遗传筛选已在揭示各种生命复杂过程的分子机制中起着重要的作用。但它还有一定的局限性,如:这些诱变方法所产生的突变体一般为隐性突变,所以需要经过三代才获得纯合突变体,占用空间,耗费时间,消耗劳动力;其次,基因的异位表达同样对基因功能研究非常重要,这也是传统筛选体系所缺乏的;特别是,很多基因在胚胎发育中起重要的作用,纯合突变体早期胚胎致死,因此不能利用这些突变体研究其基因在成体各种过程中的功能,如:器官再生,行为产生等。由于传统正向遗传筛选的这些缺陷,急需建立新的遗传筛选体系。 斑马鱼不仅由于养殖方便,繁殖周期短,产卵量大,体外受精,体外发育,胚胎透明等,已经广泛应用于早期胚胎发育研究,并且由于它的大多数器官如:尾鳍,心脏,肝脏,侧线,脊椎等都能再生,所以越来越多的科学家利用斑马鱼来研究器官再生分子机制。化学诱变和DNA插入诱变等正向遗传筛选方法的建立让斑马鱼成为很好的遗传模式体系。本项研究将利用斑马鱼构建可诱导显性突变体筛选体系。新的筛选体系既可用来在F1代胚胎期筛选早期发育缺陷突变体,也可用来筛选F1代成鱼尾鳍再生缺陷突变体。其基本原理为:To12介导的Tet-on启动子随机插入斑马鱼的基因组,当Tet-on启动子正向插入某个基因的5’端,在四环素处理下,此目标基因将会被过量表达;当Tet-on启动子反向插入某个基因的内部时,在四环素处理下,此目标基因的反义RNA将会被激活表达,目标基因将会被敲低。从700个F0斑马鱼中,我们筛选到了300个转基因系,在此300个转基因系的中,我们共筛选到了27个突变体,其中20个突变体仅呈现早期胚胎发育缺陷,3个突变体仅首先呈现尾鳍缺陷,4个突变体呈现两种缺陷。在此27个突变体中,共鉴定出58个基因其中包括8个非编码基因,在四环素处理下,大部分基因被诱导敲低,少部分基因被诱导过量表达。此58个基因其中包括一些已知的基因如:faf1,grb14,pcyt1aa,nidogen2,Sgcd,p2b1等,这些基因突变体在胚胎期的表型与已发表研究结果类似。我们研究证明可诱导显性突变体筛选体系是一个非常有效的遗传筛选体系。 综上所述,本课题建立了一种新型的遗传筛选体系,特别适用于成体突变体的筛选,是对传统筛选体系的很好补充。此外,该系统还可以应用于其他物种,特别是小鼠的正向遗传筛选,因为小鼠的传统正向遗传筛选,需要大量的空间,设施,一般实验室很难进行。