胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤致死原因的第二位（仅次于肺癌），淋巴转移是其最常见的转移途径且发生较早，是否伴有淋巴结转移是评估预后的重要生物学指标。研究发现，2％～4％的粘膜内胃癌、10％～15％的粘膜下胃癌、80％的进展期胃癌有淋巴结转移，其中20％的进展期胃癌有远处淋巴结如主动脉旁淋巴结转移。因此阻断胃癌淋巴结转移是减少其转移复发、改善预后的有效治疗方法。临床和病理资料显示，许多患者死于肿瘤的转移（血管转移，淋巴管转移，直接扩散），淋巴管和血管的生成为肿瘤细胞的扩散提供了通路。在过去十年中，很少有学者研究有关肿瘤淋巴管形成及其功能的分子调节。近几年来，随着多种淋巴管特异标志物如VEGFR-3、LYVE-1等的相继发现，淋巴管生成已引起了广泛关注并成为研究的新的热点。VEGF-C是目前已知的促淋巴管生长因子，属于血管内皮生长因子（VEGF）家族成员之一，研究显示在胃癌、乳腺癌、前列腺癌及甲状腺癌等肿瘤中，VEGF-C表达与淋巴管浸润和淋巴结转移有关。肿瘤细胞产生的VEGF-C与其淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3结合刺激淋巴管的生成和淋巴结转移，VEGF-C表达增高通过增加肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞的接触面积、增加管腔的通透性、改变淋巴管内皮细胞黏附性质或黏附分子的表达使肿瘤浸润转移的能力增加。近来许多实验研究工作表明VEGF-C／VEGFR-3信号传导在诱导淋巴管生成过程中具有重要作用，使阻断该信号通路是抗淋巴管生成治疗目前最常采用的策略。用于阻断VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3相互作用的主要方法包括单克隆抗体，可溶性VEGFR-3-Ig，小分子肽抑制剂，前蛋白转化酶（proprotein convertase，PCs）抑制剂、基因治疗等。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是近几年发展起来的一项特异性抑制基因表达的新方法，研究显示，RNA干扰是目前效应最强的反义技术，对同一靶目标，半抑制浓度的siRNA（small interference RNA, siRNA）是已磷硫酰化寡核苷酸的100—1000倍。RNA干扰，指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。由于其高效性、特异性，RNA干扰已成为对哺乳动物细胞进行基因选择性分析的方法，并成为获得性和遗传性疾病潜在的治疗手段。RNA干扰抑制肿瘤细胞生长的功能在体内外实验中已得到证实。目前较为常用制备siRNA的方法包括化学合成siRNA、体外转录合成siRNA、用RNaseⅢ消化长片段dsRNA、利用质粒或病毒载体表达siRNA、PCR方法制备siRNA表达框架。其中通过质粒等表达载体在细胞内直接转录siRNAs不仅经济和容易操作，而且RNAi表达载体可以进行较长期研究。带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，这使得哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。稳定转染的细胞株为长期进行生物化学分析和细胞表型的评价提供了可能。本研究设计了2条针对VEGF-C基因不同靶点的寡核昔酸序列，应用质粒构建siRNA表达载体并转染胃癌细胞株SGC-7901经RT-PCR、免疫细胞化学法、western blot检测VEGF-CmRNA和蛋白质的表达水平，研究其干扰VEGF-C基因表达的效应，筛选抑制效果最佳的序列，为进一步研究其功能奠定基础。通过计数法检测转染siRNA后SGC-7901细胞的增殖变化探讨siRNA抑制VEGF-C基因表达对胃癌细胞的效应。近年来，裸鼠移植瘤已成为人类肿瘤实验模型的重要工具。本研究通过建立VEGF-C表达抑制的移植瘤模型探讨VEGF-C基因的功能及其与胃癌淋巴管生成、淋巴管密度及淋巴结转移的关系并进行了系统的研究，为肿瘤的抗淋巴管转移提供理论和实践基础，目前国内外未见报道。第一部分VEGF-C在不同胃癌细胞株中的表达方法1．两种人胃腺癌细胞BGC-823，SGC-7901，常规RPMI-1640培养液于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，取处于对数生长期的细胞备用。细胞计数法检测细胞增殖能力，绘制细胞生长曲线；RT-PCR检测不同细胞株VEGF-CmRNA的表达水平；Western-blot法和免疫组织化学方法检测不同细胞株中VEGF-C蛋白表达水平。2．统计学处理：采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示，两样本均数比较采用t检验，检验水准为α=0.05。结果1．细胞生长曲线BGC-823、SGC-7901细胞均呈贴壁生长，细胞密度为5×10⁴／ml，此浓度细胞从换液后的第2-4d呈指数增长。2．不同胃癌细胞株中VEGF-CmRNA的表达两株细胞均有VEGF-CmRNA表达，BGC-823、SGC-7901中VEGF-C的相对含量分别是0.45±0.02、0.64±0.04。SGC-7901表达水平较高，统计分析，两者差别有显著性（p＜0.05）。3．Western Blot的结果两株细胞均有VEGF-C蛋白表达，BGC-823、SGC-7901中VEGF-C的相对含量分别是0.79±0.06、0.68±0.02。SGC-7901表达水平较高。统计分析，两者差别有显著性（p＜0.05）4．不同胃癌细胞株中VEGF-C免疫组织化学染色细胞爬片固定后，免疫组织化学染色显示，两株胃癌细胞株的胞浆中均有棕色颗粒，呈弥散分布，说明均有VEGF-C蛋白表达，但SGC-7901细胞着色较深，表达较强与Western blot结果一致。第二部分RNA干扰重组表达载体的构建和测序方法利用TAKARA公司的在线设计软件，设计、合成抑制VEGF-C基因表达的shRNA，寡核苷酸双链退火、通过与线性化的pSilencer3.0-H₁连接、转化大肠杆菌，扩增、纯化得到所需质粒，通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果1．酶切鉴定重组质粒：用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切pSilencer3.1-neo载体，然后取5ul酶切产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，产生大小约为60bp和4220bp两条带。2．重组质粒序列测定：挑取已转化质粒菌液去测序。经测序，测序结果均与目的序列相同，均符合设计要求。得到重组质粒pSilencer3.1-VEGF-C₁、pSilencer3.1-VEGF-C₂和阴性对照pSilencer3.1-VEGF-N。第三部分RNA干扰抑制SGC-7901细胞株VEGF-C表达效应的检测方法1．采用阳离子脂质体介导的方法将两个VEGF-CsiRNA表达载体和阴性对照稳定转染SGC-7901细胞株，600ug／ml为SGC-7901细胞合适的筛选浓度，200ug／ml为维持浓度。RT-PCR、Western bolt检测干扰表达载体的抑制效应，细胞计数法检测干扰表达载体是否对细胞生长有影响。2．统计学处理：采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示，均数比较采用单向方差分析（One-way ANOVA），检验水准为α=0.05。结果1．G418浓度梯度试验结果：稳定转染时，加入600μg／ml G418筛选的第3天即开始有细胞死亡，表现为细胞收缩，变圆，漂浮并聚集成团；第8天细胞大部分死亡，只剩下少量的转染细胞，这些转染细胞已恢复生长，并逐渐长大形成抗性克隆。于第18-20天将明显增大的抗性克隆转移到新的培养瓶中，当细胞长成单层，传代培养后即为稳定转染了发卡siRNA表达质粒的细胞。G418维持浓度为200ug／ml。2．RT-PCR检测转染前后VEGF-C同源家族其他基因的表达无变化，检测稳定转染前后VEGF-C的表达，两个干扰组pSilencer3.1-H₁-VEGF-C1组、pSilencer3.1-H₁-VEGF-C₂组VEGF-CmRNA都有下调，pSilencer3.1-H₁-VEGF-C1组稍明显，两组的抑制率分别是82％、65％。3．转染干扰载体后细胞中VEGF-C蛋白的变化：在两组稳定转染细胞中VEGF-C蛋白表达都有不同程度下调，其中pSilencer3.1-H₁-VEGF-C₁组下调的程度尤为明显，抑制率为81.2％，与阴性对照组相比差异具有显著性（p＜0.05）。4．转染后细胞生长曲线：选择转染效果较好的pSilencer3.1-VEGF-C₁组、阴性对照组、SGC-7901组做细胞计数，结果显示，VEGF-CsiRNA表达载体对细胞生长没有影响。第四部分RNA干扰表达载体抑制VEGF-C基因的表达的在体实验研究方法1．裸鼠皮下接种肿瘤细胞成瘤，不同时间点测定肿瘤体积和裸鼠体重的差异，肿瘤组织切片免疫组织化学染色、Western blot检测VEGF-C蛋白表达变化，免疫组织化学染色计数淋巴管的密度，评价体内环境中RNAi表达载体对肿瘤细胞VEGF-C表达及淋巴管生成的影响。2．统计学处理：采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示，均数比较采用单向方差分析（One-way ANOVA），检验水准为α=0.05。结果1．在体肿瘤的评价方法1．1肿瘤体积和肿瘤生长抑制率：三组细胞接种裸鼠后第4天可见肿瘤长出，接种后第九天开始测量裸鼠最长径L值和最短径W值，以后4天测量一次，4周后处死，根据公式V=1／2×最大直径×最小直径²计算肿瘤体积，共测量7次，实验结束时干扰组、7901组、阴性对照组肿瘤体积依次为（3.00±0.84、4.63±3.12、3.05±1.26）cm²，各组肿瘤体积略有差异，其中7901组肿瘤体积略大于其他两组，但是各组之间差异无显著性（P＞0.05），统计学结果表明对肿瘤生长没有明显抑制。1．2动物体重每四天测量裸鼠的体重，实验结束时7901组、阴性对照组、干扰组祼鼠的体重依次为（4.61±2.64、2.82±0.82、2.15±0.27）g，其中7901组肿瘤体重略大于其他两组，但是各组之间差异无显著性（P＞0.05），统计学结果表明对裸鼠体重没有明显影响。2．肿瘤标本的评价方法2．1肿瘤重量接种30天处死动物，取出肿瘤组织称重，7901组、阴性对照组、干扰组肿瘤的重量依次为（4.61±2.64、2.82±0.83、2.15±0.27）g，统计学检验结果表明干扰组与其他两组之间差异无显著性（P＞0.05）。2．2免疫组织化学染色2．1．1 RNA干扰抑制VEGF-C基因在SGC-7901成瘤组织中的表达VEGF-C蛋白主要为细胞浆表达，阳性染色主要为细胞浆染色呈棕褐色。SGC7901组染色镜下约70％-80％的面积为阳性染色。阴性对照组也表现为强阳性。而干扰组VEGF-C蛋白为弱阳性表达。2．1．2 RNA干扰抑制VEGF-C基因表达减少SGC-7901成瘤组织中淋巴管的密度光镜下可见肿瘤组织中的微淋巴管呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无管腔。微淋巴管大多集中在肿瘤边缘，肿瘤中心微淋巴管密度较肿瘤边缘相对减少。转染了干涉载体的两种肿瘤和未转染组之间值有显著性差异，干扰组MLVD为12.42±4.3，对照组为20.34±8.3，SGC-7901组为22.1±6.5，统计学处理p＜0.05，有统计学意义。2．3 Western blot检测成瘤组织中VEGF-C蛋白的表达Western blot检测成瘤组织中VEGF-C蛋白的表达提示，干扰组与其他两组相比，VEGF-C蛋白表达下调，抑制率为60％，但较稳定转染细胞相比，有所上调。结论1．人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901均有VEGF-C的表达，伴有淋巴结转移背景的SGC-7901细胞株VEGF-C表达强。2．成功构建了VEGF-CsiRNA表达载体。3．VEGF-CsiRNA表达载体在体内和体外均可抑制SGC-7901细胞株中VEGF-C的表达。4．成功构建了裸鼠皮下移植瘤模型，抑制体内VEGF-C基因表达，减少肿瘤淋巴管的生成，淋巴管的密度降低。5．抑制VEGF-C表达对肿瘤的生长没有影响。6．RNA干扰技术可以特异和高效的抑制VEGF-C基因的表达，并且抑制效果可以维持四周以上，为胃癌的淋巴管转移的治疗研究提供了理论基础。