周期性应力加载对C2C12细胞自身抗原及TLR3表达的影响

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背景:特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies,IIMs)是一组异质性的骨骼肌自身免疫性疾病,临床上以进行性肌无力伴骨骼肌炎症细胞浸润为特征。根据不同的临床及组织病理形态学特征,炎性肌病可分为多发性肌炎(polymyositis, PM)、皮肌炎(dermatomyositis,DM)和包涵体肌炎(inclusion-body myositis, IBM)。广泛出现的毛细血管周围(DM)、肌束膜和肌内膜(PM, IBM)的多种炎性细胞浸润是炎性肌病的特征性病理改变。肌组织内渗出的巨噬细胞,单核细胞,中性粒细胞等释放多种化学因子和趋化因子,或协同炎性肌纤维(表达MHC-I)发挥抗原呈递(APCs)作用,动员炎性肌组织内T细胞的渗出和/或原位克隆,通过释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒性因子,杀伤与之接触的、或远距离的肌纤维,引发持续而反复的肌纤维坏死和无效的成肌再生。自身免疫性肌炎患者的临床特征性表现为进行性加重的肌无力、肌纤维化和肌萎缩(以近端肌肉更为严重)。患者最终因肌纤维的丧失和肌组织的纤维化,出现骨骼肌收缩能力的完全丧失。磁共振波谱检测证实,由于毛细血管减少,肌细胞线粒体功能障碍,炎性肌细胞出现三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(PCr)含量下降,导致肌纤维能量代谢障碍、肌无力持续加重,以及成肌再生不良。目前治疗IIMs主要以皮质类固醇联合免疫抑制剂为主,虽然部分患者经药物治疗后肌肉性能得到改善,但仅能恢复肌肉部分功能;多数患者经长疗程治疗后仍残留功能受限和生活质量低下,而长期高剂量使用皮质类固醇和免疫抑制剂会导致慢性骨和肌肉代谢损伤。近年的研究证实,运动和拉伸训练能改善IIMs患者肌肉收缩强度,减少肌肉损伤,改善肌肉性能。此外,力学刺激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激,调节细胞的新陈代谢和基因表达过程,在成肌细胞激活、增殖与分化中起着重要作用。国内外已有大量研究证实力学刺激能促进成肌细胞增殖,肝细胞生长因子(HGF)已被证实是唯一一种能激活体内或体外培养的静止期成肌细胞进入细胞周期的生长因子。通过检测DNA掺合溴脱氧尿核苷的方式,Tatsumi R的研究组发现:力学刺激体外培养的成肌细胞2小时,可导致HGF活化;进一步的研究发现力学刺激促进一氧化氮合成酶(NOS)激活,诱导HGF释放,导致成肌细胞活化增殖。Tatsumi R因此总结出力学刺激导致成肌细胞增殖的力学信号通道:Calcium-Calmodulin复合物形成、NOS和金属蛋白酶(MMPs)激活、HGF释放并结合C-met受体,从而促进成肌细胞增殖。生理条件下,骨骼肌组织表达极微量的肌炎自身抗原,而炎性肌组织中反复再生的不成熟肌纤维则持续高表达特异性的肌炎自身抗原,如histidyl tRNA synthetase (HRS/Jo-1), Mi-2(DM患者),U1-70,以及Ku/the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs),体外培养的成肌细胞表达高水平的自身抗原,但随着成肌细胞分化融合并形成肌管,自身抗原逐渐下调,这表明在自身免疫性肌病的发生发展过程中,自身抗原主要由再生的肌纤维合成和表达,炎性过程的启动和发展并不涉及成熟的肌管。炎性肌病的发展过程中,表达自身抗原的再生肌纤维成为细胞毒性攻击的目标,反复发生的肌纤维坏死和成肌再生分化导致自身抗原的持续产生,从而引发肌炎的病理过程和免疫反应的持续性和不可修复性。此外,作为Ⅰ型跨膜蛋白,Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)成员在先天性免疫反应,尤其是调节吞噬细胞(如巨噬细胞等)特异性识别微生物病原体抗原,分泌促炎细胞因子,上调共刺激分子并诱导机体获得性免疫反应过程中发挥重要调控作用,被称为先天性和获得性免疫调节中的辅助受体.近期的研究(Tournadre A,2010)发现,自身免疫性肌炎患者的骨骼肌组织呈现TLR3和TLR7的阳性表达,尤其高表达于成肌细胞,并经由TLR信号通路,促使Thl和Th17相关细胞因子分泌释放,加速肌纤维的坏死和收缩功能的丧失。炎性肌病以肌组织的坏死、肌萎缩和收缩力减弱或丧失为特征,那么,肌炎自身抗原、TLRs在增殖的成肌细胞内呈现高表达的特性与成肌细胞的力学信号之间是否存在相关性,力学信号是否直接指导并参与肌炎自身抗原的启动以及Toll受体的表达?力学信号的减弱或消失是否促进或降低自身抗原和Toll受体的表达,从而加速肌纤维的坏死并影响炎性肌病的发生和归宿?本实验对体外培养的C2C12细胞进行周期性的促增殖应力加载刺激,检测力学加载前后成肌细胞自身抗原和TLRs的表达,判断力学信号是否促进或抑制成肌细胞自身抗原和TLRs的表达和释放。在此基础上,采用不同的拮抗剂或促进剂于扰成肌增殖特定的力学信号分子,进一步分析成肌细胞内特定力学增殖信号分子(Calcium,Calmodulin,NOS,MMPs,HGF,C-met)对自身抗原和TLRs表达可能的干扰作用,从而揭示骨骼肌收缩能力与肌炎自身抗原、TLRs的相关性。主要研究内容第一章筛选促进C2C12细胞增殖的应力加载条件[目的]周期性应力加载的力学条件通过Flexercell5000加载系统实现,通过流式细胞术检测C2C12细胞周期,筛选促C2C12细胞增殖的力学刺激条件。[方法]C2C12细胞常规复苏后用含100mg/L的青霉素、100mg/L的链霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基,37℃5%C02培养箱中培养,将生长状态良好的C2C12细胞按1×105/mL密度接种于包被Ⅰ型胶原的Bioflex6孔培养板上贴壁培养24小时后,以0.25Hz频率、10%拉伸幅度进行2天、4天和6天周期性拉伸;细胞培养分组:①2天对照组:常规培养。②2天拉伸组:置于Flexercell5000柔性基底加载系统进行每天2小时力学加载,连续加载2天。③4天对照组:常规培养,2天后常规更换培养基。④4天拉伸组:置于Flexercell5000柔性基底加载系统进行每天2小时力学加载,连续加载4天。⑤6天对照组:常规培养,第2天和4天后常规更换培养基。⑥6天拉伸组:置于Flexercell5000柔性基底加载系统进行每天2小时力学加载,连续加载6天。另外,以1Hz频率、15%拉伸幅度拉伸1小时,23小时后收集细胞。倒置相差显微镜下观察C2C12细胞形态、生长情况和细胞脱落情况。分别在相应天数收集细胞进行流式细胞周期检测。流式结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test),P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]C2C12细胞贴壁生长,接种后4小时大部分已贴壁,呈椭圆形或不规则形,12小时后完全伸展呈梭形及多角形,细胞数量逐渐增多;采用0.25Hz频率、10%拉伸幅度的拉伸加载条件:2天时,拉伸组C2C12细胞的增殖情况较对照组明显;4天时,对照组和拉伸组可见C2C12细胞出现分化,而6天时,两组均可见细胞部分融合。采用1Hz频率、15%拉伸幅度的拉伸加载条件:拉伸组的细胞脱落明显。通过流式细胞术(flo wcytometry,FCM)检测每组3个样本细胞的分裂增殖周期,C2C12细胞的增殖情况用DNA增殖指数表达:[DPI%=(S%+G2/M%)/(S%+G2/M%+GO/G1%)],2天时,拉伸组DPI%为(37.00±1.43)%,较对照组(21.09±2.72)%明显增高(P=0.001,n=3);4天时,拉伸组DPI%为(13.89±0.99)%较对照组(11.64±0.80)%增高(P=0.038,n=3)。采用1Hz频率、15%拉伸幅度的拉伸加载条件:拉伸组凋亡细胞数量显著上升。[结论]采用0.25Hz频率,10%拉伸幅度的加载条件进行周期性力学刺激可以明显促进C2C12细胞增殖,随着细胞数量增多及分化融合,促增殖效应逐渐下降。高频率,大于15%的拉伸幅度的应力加载条件会干扰细胞活性,加速C2C12细胞凋亡。第二章周期性促增殖应力加载干扰C2C12细胞自身抗原和TLRs表达[目的]采用0.25Hz频率、10%拉伸幅度的促增殖力学刺激条件,进行2天和4天的周期性力学刺激,通过qPCR和Western blot技术检测C2C12细胞自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLRs(TLR3和TLR7)基因及蛋白的表达,采用Western blot技术检测力学信号分子(Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met).蛋白的表达。[方法]C2C12细胞按1×105/mL密度接种于包被I型胶原的Bioflex6孔培养板上贴壁培养24小时,以0.25Hz频率、10%拉伸幅度进行2天、4天周期性拉伸;细胞培养分组:①2天对照组:常规培养。②2天拉伸组:置于Flexercell5000柔性基底加载系统进行每天2小时力学加载,连续加载2天。③4天对照组:常规培养,2天后常规更换培养基。④4天拉伸组:置于Flexercell5000柔性基底加载系统进行每天2小时力学加载,连续加载4天。在相应天数收集细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,Oligo(dT)逆转录获取cDNA,经特定引物PCR扩增;用凯基全蛋白试剂盒提取总蛋白,用SDS/PAGE电泳分离后转膜,孵育一抗二抗后ECL化学发光法检测蛋白的表达。结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]以0.25Hz频率、10%拉伸幅度为拉伸加载条件,用qPCR和western blot检测C2C12细胞自身抗原和TLRs的表达情况:2天时,拉伸组的自身抗原(Mi-2、 HRS、DNA-PKcs和Ul70)和TLR3相对基因和蛋白水平表达较对照组明显降低(P<0.001,n=3);4天时,对照组与拉伸组没有明显差异。与2天对照组相比,4天对照组的自身抗原和TLR3表达降低(P<0.05,n=3)。然而在体外培养的C2C12细胞中,拉伸组和对照组都没有检测到TLR7mRNA和蛋白水平的表达。2天时,拉伸组的力学信号分子(Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met)相对蛋白水平表达较对照组明显增高(P<0.001,n=3),4天时,拉伸组仅有NOS相对蛋白水平表达高于对照组(P<0.05,n=3);而4天对照组与2天对照组比较,MMP2、 HGF和C-met表达降低(P<0.01,n=3)。[结论]短期的力学刺激可以抑制自身抗原和TLR3表达,但随着时间延长,细胞分化融合以及对力学刺激的适应,力学刺激对自身抗原表达抑制作用减弱。而力学信号分子在2天时表达水平较高,随着刺激天数增加、细胞分化融合以及对力学刺激的适应,力学信号分子表达下降。因此,在短期力学刺激对自身抗原和TLR3的表达抑制作用中,力学信号分子可能起着关键作用。第三章力学信号分子干扰体外培养C2C12细胞自身抗原及TLR3的表达[目的]在培养基中添加特定的力学信号分子的促进剂或拮抗剂,通过qPCR和Western blot技术检测C2C12细胞自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和Toll样受体TLR3基因及蛋白的表达。[方法]当细胞融合达80%左右时,用PBS清洗2次后,分别加入含有钙离子载体A23187(3μmol/L)、钙离子螯合剂EGTA(1.8mmol/L)、调钙蛋白Calmodulin(1μg/ml)、调钙蛋白抑制剂Calmidazolium Chloride(0.3μmol/L)、 NOS促进剂SNP(30μmol/L)、NOS抑制剂L-NAME(10μmol/L)、MMP-2(10ng/ml)> MMP-2抑制剂1(250ng/ml)、重组HGF(20ng/ml)、anti-HGF兔多抗(2μg/ml)、重组C-met(lμg/ml)、anti-C-met兔多抗(2μg/ml)的DMEM,置于37℃、体积百分比为5%CO2的细胞培养箱中培养4小时后收集细胞。用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录得到cDNA,经特定引物PCR扩增;用凯基全蛋白试剂盒提取总蛋白,用SDS/PAGE电泳分离后转膜,孵育一抗二抗后ECL化学发光法检测蛋白的表达。结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若差异有统计学意义,则采用LSD检验进行两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]采用qPCR和Western blot技术对所获取的C2C12细胞进行检测:A23187组的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3的相对基因及蛋白水平的表达较对照组降低(P<0.001, n=3), EGTA组则相反;Calmodulin组的自身抗原(HRS和DNA-PKcs)和TLR3相对基因及蛋白水平的表达较对照组降低(P<0.05, n=3), Calmidazolium Chloride组的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)较对照组升高(P<0.05,n=3)。SNP组的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3的相对基因及蛋白水平的表达较对照组降低(P<0.001,n=3), L-NAME组则相反。MMP-2组的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3的相对基因及蛋白水平的表达较对照组没有明显差异,MMP-2抑制剂1组的较对照组降低(P<0.05,n=3)。重组HGF组的自身抗原(HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3的相对基因及蛋白水平的表达较对照组降低(P<0.05,n=3), anti-HGF兔多抗组的自身抗原(Mi-2、HRS和DNA-PKcs)和TLR3较对照组升高(P<0.05,n=3)。重组C-met组的自身抗原(Mi-2、HRS和U1-70)的相对基因及蛋白水平的表达较对照组降低(P<0.05, n=3),anti-C-met兔多抗组的自身抗原(Mi-2、HRS和U1-70)和TLR3较对照组升高(P<0.05,n=3)。[结论]上调C2C12细胞内Calmodulin和NOS能明显抑制自身抗原和TLR3的基因及蛋白表达。MMP-2的细胞内高浓度对自身抗原和TLR3的相对基因及蛋白水平的表达没有明显影响,但MMP-2抑制剂1显著抑制自身抗原表达。上调细胞内HGF和C-met导致抑制自身抗原(除外重组HGF组的Mi-2和重组C-met组的DNA-PKcs)和TLR3(重组C-met对TLR3没有明显抑制作用)的表达,HGF和C-met抑制剂能促进自身抗原(除外anti-HGF兔多抗组的U1-70和anti-C-met兔多抗组的DNA-PKcs)和TLR3的表达。结果表明,在力学刺激对自身抗原和TLR3的基因及蛋白水平的表达抑制作用中,力学信号分子起着重要作用。
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