DNA胞嘧啶5位碳原子(C5)的甲基化是哺乳动物最常见的表观修饰之一。这类修饰由DNA甲基转移酶催化。哺乳动物DNA甲基转移酶包括DNMT1、DNMT2和DNMT3。DNMT1和DNMT3分别负责DNA甲基化模式的维持和从头甲基化,DNMT2仅具有微弱的体外DNA甲基化活性,但其是否甲基化DNA一直有争议。2006年发现人源DNMT2(Homo sapiens DNMT2,hDNMT2)主要甲基化真核t RNAAsp(GUC)的38位胞嘧啶。目前已知的DNMT2真核t RNA底物还包括t RNAGly(GCC)和t RNAVal(CAC)。最近研究报道硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)的t RNAGlu(UUC)也是Gs DNMT2的底物。但DNMT2如何识别t RNA底物并不清楚。本论文从优化hDNMT2的体外甲基化缓冲液条件入手,探讨了二硫键的形成对hDNMT2的结构及其体外t RNA甲基化活性的影响,及GSH或GSSG应激对细胞内hDNMT2的定位、蛋白表达和t RNA C38位甲基化水平的影响;分析了hDNMT2对不同t RNA底物的偏好性,以及t RNA结构中影响hDNMT2甲基化活性的重要元件;还初步探讨了hDNMT2体外甲基化DNA的活性;最后分析了hDNMT2序列中对底物t RNA和DNA选择起关键作用的结构域。本论文的主要研究结果如下:1.hDNMT2体外甲基化条件的优化通过优化甲基化缓冲液中的Mg2+、EDTA和DTT的浓度以及盐的类型与浓度,在37°C,使用含有50 m M Tris(p H 7.5)、50 m M NH4OAc、1 m M Mg Cl2、0.1 m M EDTA和6 m M DTT的缓冲液时,hDNMT2的t RNA甲基化活性最高。hDNMT2甲基化t RNA的活性对DTT浓度敏感,推测纯化的hDNMT2蛋白中可能存在二硫键。2.hDNMT2分子间二硫键的形成DNMT2同源蛋白模建结构分析表明hDNMT2中的半胱氨酸形成分子内二硫键的可能很小。Native-PAGE电泳试验结果表明降低DTT浓度,hDNMT2形成多聚体,因此纯化的hDNMT2蛋白分子间可能存在二硫键。利用LC-MS/MS分析发现,2.5m M DTT条件下纯化的hDNMT2主要由分子间二硫键C292-C292形成二聚体。在细胞中,GSH起着断裂二硫键,保持蛋白半胱氨酸残基的自由巯基的作用。圆二色谱试验结果表明DTT和GSH浓度的变化导致hDNMT2的构象发生显著变化,且二者变化趋势相近。GSH或GSSG应激HEK293T细胞使hDNMT2在细胞质中定位增加,且细胞核中聚集,影响了细胞的增殖生长。GSH应激破坏hDNMT2分子间的二硫键,提高了细胞内t RNA的甲基化活性。3.tRNA甲基化识别机制及新的tRNA底物hDNMT2对不同真核t RNA底物t RNAGly、t RNAVal、t RNAAsp和t RNAGlu的甲基化活性依次减弱,说明hDNMT2体外的偏好底物为t RNAGly。因此对t RNAGly转录本做了点突变和截短突变体,并进行CD波谱分析,以及hDNMT2对其甲基化活性的研究。结果表明反密码子环的碱基可能处于活性中心部位,D-环和T-环上的保守碱基对维持t RNA的三级结构有重要意义,并发现影响hDNMT2甲基化活性的重要t RNA元件。利用生物信息学分析选取了含有部分相似元件的t RNA,发现hDNMT2体外对t RNAGln(CTG)有弱的甲基化活性。t RNA结构中影响hDNMT2甲基化活性的重要元件,对RNA适体药物碱基修饰,延长药物半衰期具有重要意义。4.DNMT2的DNA甲基化机制研究hDNMT2表面电荷分析表明,hDNMT2可能与特异序列的DNA片段结合;动力学模拟进一步揭示hDNMT2与DNA潜在的相互作用机制。琼脂糖凝胶电泳酶切试验的结果表明hDNMT2可结合该DNA片段,有效防止内切酶切割DNA片段。最后甲基化酶学试验验证hDNMT2体外能甲基化该DNA片段。但是hDNMT2的DNA甲基化活性和作用机制还有待于体内深入研究。5.影响DNMT2底物选择的结构域生物信息学分析和酶学试验结果表明,伴随物种进化,TRD1和TRD2结构域出现在DNMT2同源体序列中,对DNMT2底物t RNA或DNA选择起关键的作用。TRD1和TRD2区域内S219、S223、G224、I228、L229和G305对hDNMT2的t RNA底物选择起重要推动作用。序列比对、亲水性和表面潜电势分析,表明hDNMT2对t RNA的偏好性可能与TRD1结构域有关。TRD2结构域作为癌症突变的高发区域,且癌变体的活性严重影响hDNMT2的甲基化活性。本研究发现影响hDNMT2甲基化活性的重要残基和结构域,对研发高效特异的抗肿瘤药物、抗病毒药物和抗寄生虫药物,具有重要的意义。