论文部分内容阅读
近二十余年来，辅助生育技术和分子生物学技术蓬勃发展，植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)在二者有机结合的基础上应用而生。1990年，HandysideAH成功地完成了世界上第一例PGD，近年来PGD自身检测技术的不断完善，新的分子生物学技术不断应用，除了聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)及荧光原位杂交(Fluorescenceinsitu，FISH)两种技术应用于PGD，在此基础上还衍生了一些新的技术。如核转化诱导的染色体进行光谱核型分析(Spectralkaryotyping，SKY)或24色多色FISH技术(Multi-fluorochromekaryotyping)分析，单细胞全基因组扩增及比较基因组杂交技术(Comparativegenomichybridization,CGH)，引物原位标记技术(Primedinsitulabeling，PRINS)等，这些技术的出现为PGD的进一步发展拓展了更为广阔的空间。PGD应用范围不断扩大，除了可以进行性连锁疾病、单基因遗传性疾病、染色体结构和数目的异常的检测，还可用于人类肿瘤易感综合征的易感性分析及一些迟发性疾病的基因预测，以及应用PGD技术进行HLA配型。到2004年为止，全世界已进行了超过6000个临床PGD周期，诞生了1000多个健康婴儿。
染色体易位是一种常见的遗传缺陷，它是指两条及两条以上染色体的断裂产生的染色体片段位置的改变。平衡易位是最常见的染色体结构异常。据报道，群体中相互易位的发生率约为1/500～1/1000，罗式易位的发生率约为1/900～1/1000。而在不育及反复自然流产患者中，易位的发生率显著增高达1％～10％。染色体易位的携带者一般都没有遗传物质的丢失或者是丢失不多，因而表型正常，但可将不平衡的染色体传给子代，导致流产、死胎、畸形儿或不孕不育等。部分男性携带者还可能因染色体断裂区域涉及精子发生相关基因或调控基因而伴有生精障碍导致不育。因此染色体结构异常伴随的生育障碍对患者的身体及精神方面均带来极大的危害。对于渴望生育健康正常后代的夫妇来说，以前所能借助的方法是在孕早期或孕中期行产前诊断取羊水细胞或绒毛对胎儿进行遗传学诊断，和借助于B超诊断胎儿有无形态学异常，但往往面临要选择流产或引产的难题，植入前遗传学诊断的出现，为这些患者提供了除产前诊断以外另一种选择，能早期同时解决生育及遗传诊断这两大难题，实现他们生育正常后代的愿望。
目前对染色体异常患者进行PGD有两种途径，即对极体或卵裂球进行染色体分析，最常用的分析方法是荧光原位杂交。在用FISH技术诊断染色体易位时，主要有以下几种方法：(1)活检处于分裂间期的卵裂球，采用两种易位染色体的端粒探针和其中一条染色体断裂点近端探针联合的方法进行FISH(对于罗氏易位携带者，采用易位的染色体的位点特异性探针)。用卵裂球进行PGD存在的问题主要是难以区分正常和平衡的胚胎，不能真正实现优生的目的，另外卵裂阶段的胚胎嵌合体发生率很高，卵裂阶段单个卵裂球的检测并不能代表整个胚胎的状态，可能造成漏诊和误诊。(2)采用跨断裂点探针筛选跨越或是临近断裂点的克隆，并标记上不同的颜色，通过不同颜色信号的分离和重叠，可分辨各类染色体结构异常，包括染色体平衡和非平衡易位、倒位、染色体内部重组和微缺失等，但由于跨断裂点探针制作周期较长，费用较高，该技术亦未能广泛应用于临床。(3)间期核转换，近年来有学者发展了从间期核获得中期染色体的技术，Verlinsky等进一步发展了该技术并将其应用于PGD，用活检获得的卵裂球与去核的鼠合子融合，得到分裂期的染色体，用全染色体涂抹探针(wholechromosomepaintingprob,WCP)结合着丝粒探针(centromereenumerationprobe，CEP)和端粒探针，可应用于各种染色体易位的PGD，但这种方法较为复杂，需要特殊的仪器设备(如电融合仪等)、显微操作技术和中期核固定技术，耗时、费力，有效性有限，难以临床普遍开展。(4)近年来，也有学者尝试将比较基因组杂交应用于染色体易位的分析，该技术不需染色体培养，一次杂交实验即可检测出待测样本整个基因组情况，弥补了FISH仅能检测个别染色体或部分位点的不足，但CGH实验过程繁琐，对操作人员和图像分析系统要求高，且整个过程需要时间较长，诊断后的胚胎需要冷冻，该技术普遍应用于临床尚需一段时间。(5)对于女方染色体易位携带者，还可以采用第一极体进行分析。由于第一极体的染色体在排卵后有限的时间内处于分裂期，可用WCP探针通过FISH方法检测第一极体的染色体结构来推断卵子染色体组成。应用第一极体进行植入前诊断具有安全性高、避免伦理道德的冲突以及胚胎期高比例的嵌合型的影响等优点，能够区分正常和平衡易位胚胎，还能为研究卵子分离的规律提供信息。1998年Munné等首次应用第一极体对女性染色体易位携带者进行PGD，获得了成功妊娠。但由于极体活检和固定的难度高，以及极体本身一些生物学特性的限制，应用全染色体涂抹探针对第一极体进行FISH的研究不多，我国尚未见相关报道。
本研究将针对染色体易位携带者引起的不育及反复自然流产等生育难题采用第一极体进行PGD研究，包括两部分，第一部分建立应用WCP进行第一极体染色体分析的方法，了解该方法对女性染色体易位携带者进行PGD的可行性并探讨具体操作方法；第二部分用第一极体FISH方法对染色体易位携带者进行植入前遗传学诊断，降低染色体易位患者的自然流产率，使其能够生育表型和基因型均正常的健康后代。