本文主要从以下几方面进行论述：　　第一部分 SSUH2基因在牙齿发育中的分子机制研究　　目的:　　揭示SSHU2基因导致牙本质发育不良疾病的分子调控机制，筛选出与SSUH2互作的蛋白，阐明该基因参与的牙齿发育相关通路。进一步完善对SSUH2基因的研究，并为牙齿尤其是牙本质和牙根的生理发育机制及相关的信号通路补充新的理论知识。　　方法:　　1、研究材料:HEK293T细胞、牙龈成纤维细胞(HGF)、Ssuh2 knock out小鼠　　2、构建SSUH2表达载体。本研究选用pcDNA-3.1(+)-flag以及pET-41a(+)（带GST标签）来构建SSUH2过表达载体。在SSUH2的CDS区的正向引物5端连入BamHⅠ，反向引物5端连入HindⅢ，并通过这两个酶切位点将SSUH2连入pcDNA-3.1(+)-flag载体当中。pET-41A(+)-SSUH2载体构建引物的酶切位点加入顺序刚好相反，HindⅢ酶切位点加在SSUH2的CDS区正向引物5端，BamHⅠ酶切位点则加在反向引物5端，以此来将SSUH2连入pET-41A(+)原核表达载体当中。　　3、构建人SSUH2基因的过表达稳转HGF细胞株。将野生型和突变型的SSUH2基因分别构建到C端融合myc标签的慢病毒载体上，包装慢病毒，筛选出野生型和突变型SSUH2稳转HGF细胞株和空载对照HFG细胞株，并利用荧光定量PCR进行验证。　　4、利用免疫共沉淀(CO-IP)筛选与SSUH2有相互作用的蛋白。在HEK293T细胞中过表达flag-SSUH2融合蛋白，并利用flag标签抗体进行CO-IP实验，将IP产物进行SDS-PAGE电泳并用硝酸银染色，质谱技术鉴定差异表达的蛋白条带，并用CO-IP以及免疫印迹进行验证。　　5、运用RNA-seq技术在Ssuh2 knock out小鼠体内筛选出受Ssuh2表达量影响的基因。选取胚胎期15天的同一窝基因型为Ssuh2-/-与Ssuh2+/+的纯合缺失及野生型小鼠，进行RNA-seq实验。　　结果:　　1、成功构建了野生型和突变型的SSUH2过表达稳转HGF细胞株，荧光定量结果显示，野生型及突变型SSHU2过表达的稳转细胞株的SSHU2mRNA的量是对照组细胞的20倍以上(p=0.0001＜0.05)。　　2、构建了pcDNA3.1(+)-flag-SSUH2 WT/MUT真核表达载体及pET-41A(+)-SSUH2 WT/MUT原核表达载体，所有载体均经过双酶切后电泳及测序验证，结果显示载体构建准确。　　3、HEK293T细胞转染pcDNA3.1(+)-flag空载及pcDNA3.1(+)-flag-SSUH2，再用Flag抗体进行CO-IP实验，然后取IP产物进行SDS-PAGE电泳，随后进行硝酸银染色，在过表达SSUH2蛋白的SDS-PAGE胶的上样泳道的70 KDa处找出了一个差异表达蛋白条带，进一步通过质谱分析鉴定出GRP78这个基因。有报道称该基因介导了牙本质基质蛋白DPM1的入核。　　4、在野生型、纯合Ssuh2缺失型及纯合Ssuh2插入型小鼠的转录组中找到了29个差异表达基因。其中与牙齿、骨骼发育相关的基因有Col2a1、Col10a1、Matn1，它们在Ssuh2 knock out小鼠中的表达均下调。　　结论:　　RNA-seq及荧光定量PCR实验结果显示SSHU2基因的表达会影响到COL2A1、COL10A1、MATN1、FOS这些基因的表达。Ssuh2 knock out小鼠的Clo2a1、Col10a1、Matn1基因表达下降，导致小鼠牙齿胶原蛋白的减少，使得牙本质矿化异常，从而产生牙本质发育不良表型。而且，Ssuh2 knock out小鼠的Fos基因表达增加。我们认为这是因为Fos是Ssuh2的转录因子，而且它们的表达模式还存在负反馈调控。由于小鼠体内Ssuh2表达降低，刺激Fos表达量增加，从而加强对Ssuh2基因的转录表达。　　本研究通过一系列分子实验找出GRP78、COL2A1、COL10A1、MATN1、FOS等与牙齿发育的相关基因，揭示了SSUH2基因与牙齿发育的重要基因的联系，为后续进一步研究SSUH2基因参与牙齿发育信号通路的发掘提供了重要的信息。　　第二部分 一个掌跖角化牙周破坏综合征家系CTSC基因突变鉴定及产前诊断　　目的:　　在本研究中，对来自广东惠州的一个掌跖角化牙周破坏综合征家系进行临床表型分析和通过对相关致病基因CTSC的鉴定和分离，揭示其发病的分子机制。同时，随着二胎政策的放开，为患者家庭生育二胎进行产前诊断和进一步的遗传咨询，从而在一定程度上预防患儿出生，达到提高人口素质的目的。　　方法:　　1.研究对象:来自广东惠州的一个掌跖角化牙周破坏综合征家系，先证者是一个四岁的小女孩，出生两年后开始出现双侧掌跖部皮肤粗糙、脱屑，在南方医院进行口腔牙齿的治疗。　　2.研究方法:通过临床表型、口腔检查等对患者进行临床诊断;通过PCR扩增CTSC基因7个外显子，之后采用Sanger测序法对家系所有成员进行CTSC基因突变筛查;随后运用PolyPhen-2和SIFT软件对CTSC基因c.901G＞A突变进行有害性预测;同时，利用Swiss-Prot软件对CTSC蛋白野生型及突变型进行了三级结构预测;并采用荧光定量PCR技术对患者及其父母的CTSC基因mRNA进行定量分析，以及利用细胞转染及免疫印迹等技术对野生型和突变型CTSC蛋白表达量进行研究。　　结果:　　1、系谱及表型分析结果:通过对病人口腔及皮肤等部位的临床检查，确诊病人患有掌跖角化牙周破坏综合征(PLS)，该疾病为常染色体隐性遗传病，致病基因为CTSC。　　2、CTSC基因突变位点确定:利用primer3.0及oligo7软件设计了7对针对CTSC外显子的引物，并对PLS家系成员基因组CTSC基因进行PCR扩增测序，测序结果通过NCBI-Blast进行比对分析。结果显示，患者(Ⅲ1) CTSC基因第7外显子存在c.901G＞A纯合错义突变，家系其他成员Ⅰ1，Ⅰ3，Ⅱ1及Ⅱ2均出现c.901G＞A的杂合突变。该碱基突变后，CTSC蛋白第301号氨基酸由甘氨酸变成丝氨酸(p.G301S)。　　3、mRNA水平分析:为探究CTSC基因c.901G＞A纯合突变与杂合突变在体内的转录水平，本课题对家系中患者(Ⅲ1)与携带者Ⅱ1、Ⅱ2进行外周血CTSC基因mRNA定量。结果显示，该家系PLS患者患者(Ⅲ1)的CTSC基因转录水平与携带者Ⅱ1、Ⅱ2的CTSC基因mRNA表达量差异无统计学意义(P=0.48＞0.05)。　　4、产前诊断:由于该家系已有一名患者(Ⅲ1)，建议患者母亲(Ⅱ1)在二胎怀孕16-20周采集羊水进行产前诊断。该家系成员患者母亲(Ⅱ1)在怀孕18周于惠州市第一妇幼保健院产前诊断中心进行B超监测下羊膜腔穿刺，取得羊水10 ml。羊水DNA采用酚/氯仿法进行提取，将得到的DNA运用设计的CTSC基因第七号外显子引物进行PCR扩增，送测序分析。结果显示，胎儿的CTSC基因同样存在纯合c.901G＞A错义突变，与该家系先证者基因型一致。　　结论:　　根据本课题组的研究，该惠州PLS家系患者(Ⅲ1)CTSC基因存在纯合c.901G＞A错义突变，该点突变有遗传病史，家系成员Ⅰ1，Ⅰ3，Ⅱ1及Ⅱ2均携带c.901G＞A的杂合突变。通过荧光定量PCR实验发现，患者(Ⅲ1)及其父母(Ⅱ1、Ⅱ2)外周血CTSC基因转录的mRNA量差异无统计学意义。而且，免疫印迹实验进一步证实野生型CTSC蛋白与突变型CTSC蛋白表达量差异亦无统计学意义，说明该点突变不影响CTSC基因的转录翻译。CTSC基因突变有害性预测显示该点突变有害，SIFT和PloyPhen2预测结果非常相符，同时，PloyPhen2结果显示该位点位于CTSC蛋白的高度保守区。Swiss-Port进行三维构型后结果发现，突变位点位于α螺旋附近，突变后造成突变型蛋白与野生型蛋白存在两部分不一致的区域。故此，笔者的结论是该CTSC基因c.901G＞A突变后编码的组织蛋白酶C活性急剧下降是由于蛋白构象发生了改变，从而影响了其正常的功能。　　罕见病的预防最关键是孕期进行产前诊断，本研究家系成员Ⅱ1在怀孕18周到医院进行羊膜腔穿刺，通过对胎儿致病基因进行特异性扩增测序，检测出胎儿同样存在纯合的c.901G＞A错义突变。本课题的研究思路是先对单基因疾病进行临床诊断，通过查阅国内外对该疾病的研究，确定候选的致病基因，设计引物扩增致病基因，并进行测序分析进一步确定突变位点，再根据结果进行后续的产前诊断，这一模式有利于预防单基因罕见病患儿的出生，提高了我国出生人口的素质。　　本课题首次在中国人群中报道了CTSC基因c.901G＞A突变导致掌跖角化牙周破坏综合征，扩展了我国CTSC基因的突变谱，并且为该家系提供了定制的产前诊断服务。