研究背景白血病在我国发病率约为4-5/10万,他是导致是青少年死亡的首位疾病,它是在造血过程中由于某一阶段细胞克隆扩增而产生的造血系统恶性疾病。近来,随着环境污染的逐渐加剧,累积损伤造成白血病发病率越来越高,难治性越来越强。白血病是较常见的造血系统恶性肿瘤,是一种造血系统紊乱性疾病。目前治疗白血病的方法主要有放疗、化疗和骨髓移植等,但这几种方法都面临着愈后复发的问题。Bonnet D等首次从AML患者骨髓中首次分离出CD34+CD38-表型的白血病细胞亚群,并将该表型的细胞移植给非肥胖性糖尿病／重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。发现该细胞群有强大的自我更新及增殖特点,它能启动除急性早幼粒细胞白血病(M3)外各型AML的形成,并在二次移植受体鼠体内观察到同样的结果。至此,人们开始认识到白血病患者体内存在白血病干细胞(LSC)被认为是白血病发生、发展及治疗后复发的根源,其原因为白血病干细胞(LSC)具有自我更新、多分化潜力及增殖强等特性。目前急性髓系白血病(AML)占白血病的60%。除M3型外,AML各个型别(MO-M5)来源的LSC均表达相同的免疫表型CD34+CD38-这与正常骨髓HSC表面特征相似。白血病干细胞处于细胞克隆初始阶段,与白血病细胞的恶性增殖相关,在白血病的发生和发展起关键作用。由于白血病干细胞处于细胞分裂的休眠期,使其对常规剂量药物和放射损伤产生强大的抵抗力,甚至对人体致死剂量药物和全身照射也产生耐受和抵抗。临床上的治疗的指导思想增强放化疗力度以往往是尽可能提高杀灭白血病细胞的数目。这样的治疗往往缺乏靶向性,这样的治疗不仅仅有很大的盲目性,而且很难达到真正的治愈,不仅浪费了医疗资源,而且给患者及家属带来了精神上及经济上不必要的痛苦。所以只有靶向白血病干细胞或提高白血病干细胞对放化疗的敏感性,才能彻底治疗白血病、预防缓解后复发提高长期存活率,达到真正意义上的生物学缓解。因此目前急需寻找能够靶向白血病干细胞提高化疗有效性的药物或者新的治疗手段以最大限度的清除耐药和免疫抵抗的白血病细胞,预防复发。PI3K/AKT/mTOR信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K之所以作为治疗肿瘤的靶点引人注目,主要是因为它处于众多调节细胞功能的众多重要信号通路的关键信号位置。磷酸肌醇3-激酶(PI3K:phosphatidyinositol3-kinase)是一个脂激酶家族,目前多指Ⅰ型PI3K,它们可以催化PIP2磷酸化成为PIP3从而激活下游的蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(AKT:protein-serine-threonine kinase)。AKT又可磷酸化mTORC1来促进蛋白质合成和细胞生长,还可以通过mTORC1来上调缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor1α)和血管内皮生长因子促进血管生成。另外AKT也可被mTORC2激活。mTOR (mammalian target of rapamycim)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,是一种丝氨酸／苏氨酸激酶。处于PI3K信号通路的下游,在细胞中mTOR以mTOR1和mTOR2的催化亚基形式存在,这两种复合物参与细胞基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等过程。近年来许多研究表明细胞的恶性转化与该通路的活性异常相关。PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤的发生发展中起着重要的作用,所以PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂作为新型抗肿瘤药物得到世界的广泛关注。NVP-BEZ235是具有咪唑并喹啉结构的ATP竞争性PI3K/mTOR混合抑制剂。目前在实体瘤方面已经进入Ⅰ期/Ⅱ期临床实验阶段。该药物的喹啉氮原子与激酶铰链部位形成氢键,NVP-BEZ235通过ATP竞争抑制PI3K表现出高度抑制PI3K,它选择性阻断PI3K催化亚基p110α和p110γ,在增加浓度下也阻断mTOR1和mTOR2,也可抑制普通的PI3Kα突变。NVP-BEZ235也可显著减少mTOR激活P70S6激酶蛋白的磷酸化水平。有研究表明在实体瘤方面NVP-BEZ235表现出诱导细胞凋亡及将细胞周期阻滞在Go/G1期。Schult C等发现NVP-BEZ235联合细胞毒药物有抗急性淋巴细胞白血病增殖的作用,Baumann P等发现NVP-BEZ235对骨髓瘤有抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,并与多种药物如硼替佐米、马法兰、阿霉素等有协同累加作用。然而目前NVP-BEZ235对CD34+CD38"髓系白血病干细胞的作用作者仍未见到报道,既尚不明确NVP-BEZ235能否靶向性杀灭CD34+CD38髓系白血病干细胞。因此,我们研究NVP-BEZ235对CD34+CD38-髓系白血病干细胞KGla细胞株的生物学特性的影响,为研究NVP-BEZ235治疗急性髓系白血病提供一定的实验室基础。肿瘤的发生经历了免疫监视、相互对抗、免疫逃逸的过程。免疫系统和肿瘤细胞之间存在相互作用,免疫系统重塑肿瘤细胞的抗原性,肿瘤细胞改变免疫效应细胞抗肿瘤效应。白血病之所以能够发生,另外一个主要原因为白血病细胞能通过基因突变等多种机制逃逸体内的免疫监视。逃逸后的白血病干细胞获得克隆性增殖最终发展为白血病状态。自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞,约占人外周血淋巴细胞总数的5%-10%。NK细胞是机体抵抗肿瘤的第一道防线,在肿瘤监控中占重要地位。NK细胞过继性免疫治疗也是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。在病毒感染、恶性转化、化学刺激和炎性反应等压力诱导下热休克因子(HSF)参与转录调控促进MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子表达从而被受体识别,受体活化后进而激活NK细胞发杀伤作用。而MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子为NK细胞活化性受体NKG2D的配体。研究表明多种血液肿瘤细胞表面表达一定水平的NKG2D配体,且NK细胞的杀伤能力与其NKG2D的表达水平有关。提高NKG2D介导的NK细胞对白血病干细胞的免疫清除率对治疗白血病及预防复发有重要的作用。如何能通过药物调节和逆转白血病干细胞对免疫系统的抵抗作用,以最大限度的清除白血病干细胞成为我们下一步要研究的。那么NVP-BEZ235能否调节KG1a细胞被机体免疫细胞杀伤敏感性成为本实验第二部分研究内容。本实验将从NVP-BEZ235对CD34+CD38-KGla细胞株生物学特性的影响,以及NVP-BEZ235能否调节CD34+CD38-KGla细胞被免疫细胞杀伤的敏感性进行研究,从而为NVP-BEZ235对抗髓系白血病提供体外实验研究,了解NVP-BEZ235能否增强CD34+CD38-KGla细胞被杀伤的敏感性。第一部分：NVP-BEZ235对CD34+CD38-髓系白血病干细胞生物学特性的影响[目的]探讨PI3K/mTOR信号系统双靶点抑制剂——NVP-BEZ235对CD34+CD38髓系白血病干细胞增殖、细胞周期、凋亡和集落形成能力的影响[方法]收集实验用KGla细胞,流式细胞术检测急性髓系白血病KGla细胞表面CD34和CD38的表达；台盼蓝染色细胞计数法检测不同浓度NVP-BEZ235(0μmol/L/0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)和不同作用时间(24小时、48小时)对KGla细胞增殖的影响；流式细胞仪检测不同浓度NVP-BEZ235(完全空白对照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)作用后KGla细胞周期及凋亡变化；持续用药软琼脂克隆形成实验检测不同浓度NVP-BEZ235(0μmol/L.0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)对KG1a细胞集落形成细胞的影响。应用SPSS13.0软件进行数据分析,本实验数据资料以均数±标准差(X±S)表示,NVP-BEZ235对KGla细胞增殖抑制及克隆形成实验采用方差分析,方差齐时组间多重比较采用LSD法；不同浓度NVP-BEZ235作用下细胞周期及凋亡组间比较采用t检验。P<0.05提示差异有统计学意义。[结果]流式检测实验用KG1a细胞CD34表达率(%)为98.6±0.17,CD38表达率(%)为00.01±0.00。为白血病干细胞发育水平。DMSO (0μmol/L)对CD34+CD38-KGla细胞的增殖无影响(P>0.05)。NVP-BEZ235(0.125～1μ mol/L)对KG1a细胞增殖抑制呈现时间和剂量依赖(P<0.05)。NVP-BEZ235持续接触24小时及48小时的IC50值分别为0.597μmol/L和0.102μmol/L。同一时间点各浓度组与0μmol/L组比较差异有统计学意义(P<0.05)；同一浓度不同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.250.5μmol/L、1μmol/L的NVP-BEZ235作用24h后分别有54.07±7.18%、43.47±9.60%、80.17±3.57%、83.2±3.80%、83.2±3.80%、80.03±1.23%KG1a细胞阻滞在Go/G1期,对照组与0μmol/L组比较差异无统计学意义(P>0.05),各组与0μmol/L组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。CD34+CD38-KGla经过0μmol/L.0.125μmol/L、0.25μmol/L.0.5μmol/L、1μmol/L NVP-BEZ235持续作用24h后与对照组相比CD34+CD38-KGla细胞凋亡率未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。NVP-BEZ235(0～1μmol/L)直接持续作用下14d和21d克隆形成数目分别由375.67±21.46、706.33±87.31降至0。0.25μmol/L持续作用下集落数和集落大小明显小于对照组。0.5μmol/L及1μmol/LNVP-BEZ235直接持续作用下KGla细胞集落形成明显受到抑制,14d及21d集落形成数目为0个,倒置显微镜下观察仅见大量碎片未见集落形成。[小结]1.实验所用KGla细胞处于白血病干细胞发育水平。2.不同浓度下的NVP-BEZ235能抑制CD34+CD38-KGla细胞的增殖,并具有剂量时间依赖性。3. NVP-BEZ235能将CD34+CD38-KGla髓系白血病于细胞阻滞在G0/G1期,NVP-BEZ235对KGla细胞的增殖能力的抑制可能与其使KGla细胞阻滞在G0/G1期有关。4. NVP-BEZ235不能诱导CD34+CD38-KGla细胞凋亡。5. NVP-BEZ235显著抑制CD34+CD38-KGla细胞集落形成能力,对KG1a细胞中的具有自我更新和增殖潜能的细胞具有抑制克隆形成的能力。第二部分：NVP-BEZ235对CD34+CD38髓系白血病干细胞被活化后外周血单个核细胞杀伤的敏感性的影响[目的]探讨NVP-BEZ235对CD34+CD38-髓系白血病干细胞被活化后外周血单个核细胞杀伤的敏感性的影响及其可能机制。[方法]台盼蓝拒染法检测IC50值的NVP-BEZ235对外周血单个核细胞增殖的影响。LDH释放法检测在效靶比分别为10：1、20：1时检测未经过和经过500u、LIL-2、20ng/ml IL-15活化后的外周血单个核细胞对CD34+CD38-KGla细胞的杀伤率。流式细胞仪检测NVP-BEZ235作用24后KGla细胞表面NKG2D配体的表达的变化。应用SPSS13.0软件进行数据分析,本实验数据资料以均数±标准差(X±S)表示。NVP-BEZ235对PBMC的增殖影响用配对t检验。KGla细胞和经过NVP-BEZ235作用前后KGla细胞被未经活化的PBMC及IL-2、IL-15活化的PBMC杀伤的杀伤率用析因设计资料方差分析,NVP-BEZ235作用前后KGla细胞NKG2D配体的表达使用独立样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]PBMC在0.5pmol/LNVP-BEZ235的作用下与对照组Opmol/L相比,24小时、48小时、72小时生长抑制率分别为0.67±0.29(%)与1.17±0.76(%)、1.67±0.29(%)与1.0±0.5(%)、1.83±0.70(%)与1.83±0.29(%)。各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。未经活化的PBMC在效靶比为10：1和20：1时,KGla细胞被其杀伤的杀伤率为4.94±0.54(%)、5.59±0.55(%)二者差异无统计学意义(P>0.05)。KGla细胞被经过IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比为10：1和20：1时杀伤率分别为25.73±2.49(%)、35.05±3.39(%)二者差异有统计学意义(P<0.05)。KGla细胞被未经活化的PBMC在效靶比为10：1和20：1杀伤的杀伤率为4.94±0.54(%)、5.95±0.55(%)。经过0.5μmol/L的NVP-BEZ235作用后KG1a细胞被PBMC杀伤的杀伤率分别为4.95±1.16(%)、7.00±2.05(%)。KG1a细胞被PBMC杀伤的敏感性有一定程度的提高,但是差异无统计学意义(P>0.05)。经IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比为10：1和20：1时,KG1a细胞被其杀伤的杀伤率为25.73±2.49(%)、35.05±3.39(%)经过0.5μ mol/L的NVP-BEZ235作用后,KG1a细胞被活化后的PBMC杀伤的杀伤率分别为25.61±4.01(%)、47.49±1.65(%),二者差异有统计学意义(P<0.05)。NVP-BEZ235持续作用于KG1a细胞24小时后,该细胞表面NKG2D的配体表达与NVP-BEZ235作用前相比较未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。[小结]1.0.5μmol/L的NVP-BEZ235对PBMC的增殖无明显影响；2.活化后的PBMC杀伤效应明显高于未活化的PBMC细胞；3. NVP-BEZ235能增强KGla细胞被PBMC的杀伤敏感性。[结论]1.NVP-BEZ235对髓系白血病干细胞具有直接的抑制增殖及克隆形成的作用,其原因与该药可将髓系白血病干细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期相关；2.0.5μmol/L的NVP-BEZ235对PBMC的增殖无明显影响；3.NVP-BEZ235可以提升髓系白血病干细胞被外周血单个核细胞杀伤的敏感性；4.NVP-BEZ235可用于治疗白血病,单药治疗或联合它药治疗或与免疫细胞治疗相结合组成治疗方案仍是我们未来需要研究的方向。