论文部分内容阅读
甘草是常用的中草药,具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。由于人为破坏性地对野生甘草采挖,对甘草的保护性利用迫在眉睫。离体再生体系和发根培养技术的建立,对甘草资源的保护、基因工程研究和活性成分利用具有重要意义。本研究以乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草、黄甘草和野生光果甘草为试验材料,对甘草离体再生及毛状根诱导进行了研究,主要研究结果如下:1.建立了甘草下胚轴离体再生体系,为基因工程进行甘草品种改良及优良品种快速繁殖奠定了基础。以甘草下胚轴为外植体,对影响下胚轴离体再生不定芽的因素进行了研究,结果表明, KT具有显著作用,与6-BA、IBA结合,可高效诱导下胚轴直接产生不定芽,优化的分化培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA 0.5 mg/L,芽苗分化率平均为41.5%。同时,胀果甘草下胚轴离体再生频率最高,达44.7%;预培养4天和AgNO3 6 mg/L对甘草下胚轴再生不定芽具有促进作用。2.建立了甘草快速繁殖技术体系,为优良甘草品种的进一步开发和利用打下了基础。以甘草子带子叶茎段和带叶茎段作外植体,结果表明:乌拉尔甘草诱导的丛生苗数较多,是三个供试材料中最好的;子叶茎段是甘草快速繁殖最适宜的外植体;甘草快速繁殖体系的适宜培养基是:诱导培养基MS + 6-BA 0.5 mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA0.1 mg/L复壮培养基MS + 6-BA 2.0 mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA0.5 mg/L生根培养基MS + IBA0.5 mg/L3.建立了甘草胚性愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生体系,为甘草遗传转化和人工种子制种提供了材料。以乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草、黄甘草为材料,经愈伤组织诱导、胚性愈伤组织的形成和胚状体的产生,从基因型、外植体、激素、附加物等因素研究和分析了胚状体发生和发育的过程,结果表明,甘草胚状体发生方式有三种:一是从下胚轴形态学上端直接发生,不经过愈伤组织阶段,但诱导的胚状体少;二是经过愈伤组织阶段再分化为体胚,诱导的胚状体多;三是从游离的悬浮细胞发生,诱导的胚状体多。甘草胚状体三种发生方式分化成再生植株都比较困难。用石蜡切片和半薄切片对胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织形态和结构作了进一步的分析,发现胚性愈伤组织、胚状体和非胚性愈伤组织、非胚状体形态和结构有很大差异。几种适宜的培养基是:愈伤组织诱导MS + 6-BA 2.0 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L愈伤组织继代MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L胚性愈伤诱导MS + 6-BA 0.5mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L胚性愈伤组织继代和胚状体分化培养基MS + 6-BA 0.5mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L + ME 500 mg/L胚状体增殖MS + 6-BA 0.5 mg/L + KT 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L + ME 500 mg/L4.建立了甘草毛状根诱导的技术平台,获得了甘草毛状根,为甘草毛状根次生代谢产物的生产工业化奠定了基础。对影响毛状根诱导的因素(不同菌株,不同外植体,不同菌液浓度,不同侵染时间)进行了系统研究,结果表明:菌株LBA9402易诱导毛状根,是乌拉尔甘草的敏感菌株。下胚轴、子叶和真叶均诱导出毛状根,下胚轴转化率最高。用LBA9402发根农杆菌菌悬液稀释两倍后侵染乌拉尔下胚轴,在5~10 min左右达到最好。诱导获得的毛状根嫩、白、细、生长速度快、多分枝、多根毛、呈丛生状,并失去向地性。