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益生菌可通过塑造肠道微生态平衡和免疫稳态而改善宿主健康状况,不仅常用于预防和治疗人类肠道炎症性疾病,而且在畜禽生产上有巨大应用潜力。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是鸡肠道中最主要的共生乳杆菌之一,可作为开发鸡用益生菌的候选菌种。为提高应用效果,需要明晰益生菌与宿主间通讯交流的潜在机制。除了与宿主细胞直接接触发生相互作用外,益生菌还可通过输出功能性分子与宿主建立联系。然而,共生菌/益生菌这种向宿主递送效应分子的机制仍不甚明了。近年来,人们发现细菌分泌的胞外囊泡（EVs）是细菌成分的递送系统,在细胞间通讯中发挥重要作用。本论文以乌鸡肠道中高免疫活性的共生L.reuteri为目标菌株,探索该菌株是否能产生EVs,以及这些EVs是否能在鸡体内介导免疫调控和肠道炎症保护;然后采用体外细胞试验进一步探究这些EVs介导免疫调控的作用机制。取得的结果如下:试验一鸡肠道高免疫活性罗伊氏乳杆菌的筛选本试验通过16S rDNA测序的生物信息学方法从本实验室前期分离自乌鸡肠道中的乳杆菌中鉴定出四株L.reuteri,然后通过耐胃肠道环境试验、抑菌试验、粘附性评价试验和免疫活性评价试验,从中筛选出一株益生特性好、免疫调节活性强的L.reuteri BBC3分离株。结果显示:该菌株对含0.6%（w/v）胃蛋白酶的p H 3.0人工胃液具有良好的耐受力,在0.25%胆盐的环境中生长良好,对三种致病菌（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）均具有良好的抑制活性,对Caco-2细胞粘附率高,且可显著增强鸡HD11巨噬细胞中参与抗原提呈的分子BLB2、共刺激分子CD80和免疫调节性细胞因子（IL-6和IL-12α）的基因表达。以上结果表明,L.reuteri BBC3益生特性好且免疫调节活性强,是理想的鸡用益生菌目标菌株。试验二L.reuteri BBC3胞外囊泡（LrEVs）的分离与纯化及蛋白质组学解析本试验旨在采用基于超速离心的方法建立一套从L.reuteri BBC3培养上清中分离与纯化LrEVs的标准流程;然后采用扫描电镜、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析（NTA）等技术对纯化的LrEVs进行鉴定与分析;最后采用蛋白质组学解析LrEVs的蛋白组成,并对鉴定到的蛋白进行功能分析。结果显示:L.reuteri BBC3可分泌纳米尺寸的膜囊泡;超滤浓缩+超速离心法+梯度密度离心法可分离与纯化到数量可观的LrEVs;大多数LrEVs的粒径分布在50～150 nm之间,密度在1.127～1.199 g/m L;电镜和NTA分析结果进一步证明获得的纯化LrEVs的特征与之前报道的细菌囊泡特征基本一致。蛋白组学结果显示,LrEVs中含有较高含量的蛋白和少量的DNA与RNA,含量分别为354μg、2.9μg和12.2μg(均是换算成1×1011个囊泡的结果);在LrEVs中共鉴定出92种蛋白,这些蛋白主要来自于胞质和胞膜,主要与细菌代谢过程、蛋白酶水解、应激反应、核酸的生物合成与调控以及物质转运等生理过程有关;此外,LrEVs中还发现了一些在其它益生菌或共生菌中已被证明与免疫调节或益生作用相关的同源蛋白。上述结果提示,L.reuteri BBC3分泌的胞外囊泡含有来自母细菌的活性成分,可能在细菌-宿主间相互作用中扮演重要角色。试验三LrEVs对脂多糖诱导肉鸡肠道炎症的保护效果本试验旨在探索L.reuteri BBC3及LrEVs是否在体内具有肠道炎症保护和免疫调控作用。健康、体重一致的AA肉鸡从7日龄开始,每隔1天对试鸡灌服L.reuteri BBC3（5×109 CFU/只鸡）或LrEVs（200μg/只鸡）,直至19日龄,共灌服7次;然后在12、14和18日龄腹腔注射LPS（500μg/只鸡）。同时设置一个用PBS灌服和PBS刺激的阴性对照组,一个用PBS灌服和LPS刺激的阳性对照组。结果显示:L.reuteri BBC3及LrEVs均可显著减轻LPS刺激肉鸡引起的生产性能下降、肠道损伤、空肠绒毛高度降低与隐窝深度增加以及空肠组织中髓过氧化物酶（MPO）活性增加;L.reuteri BBC3及LrEVs均可显著抑制LPS刺激造成的空肠粘膜中促炎基因（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和MIP-1β）表达升高,并可显著增强抗炎基因（IL-10和TGF-β）的表达,但LrEVs在调控免疫反应的程度上又与L.reuteri BBC3有所差别,这说明二者的免疫调节活性并不是完全对等的。上述结果表明,在LPS诱导的肉鸡肠道炎症模型中,LrEVs具有类似于L.reuteri BBC3介导抗炎免疫调节的作用试验四LrEVs介导炎症保护的免疫调控机制研究本研究分别通过巨噬细胞试验和巨噬细胞-脾脏淋巴细胞共培养试验来探究LrEVs介导炎症保护的先天性免疫和适应性免疫调控机制,并通过肠组织培养试验来初步探索囊泡蛋白和核酸在LrEVs介导免疫调控中的作用。巨噬细胞试验:先采用共聚焦显微技术研究了鸡HD11巨噬细胞对LrEVs的内在化;然后预先用LrEVs刺激HD11细胞12 h,再用LPS刺激12 h以构建体外巨噬细胞炎症模型,培养结束后检测巨噬细胞的存活率、免疫基因表达和NF-κB活性等指标。巨噬细胞-脾脏淋巴细胞共培养试验:先用LrEVs预刺激HD11细胞12 h,培养结束后,弃去培养液,洗净细胞并转移至Transwell体系的底部小室;随即将LPS刺激肉鸡的脾脏淋巴细胞接种Transwell体系上方小室,共培养16 h,检测脾脏淋巴细胞中免疫基因表达水平。空肠组织培养试验:分别用DNase I+RNase I（DR）和蛋白酶K-琼脂糖（PK）处理LrEVs以去除核酸和蛋白,酶经75℃水浴灭活,蛋白酶K-琼脂糖额外经离心除去;然后用这些酶处理后的LrEVs预刺激空肠外植体6 h,再用LPS刺激6 h,检测培养的空肠组织中MPO活性及免疫基因表达水平。结果显示:适宜剂量的LrEVs不影响HD11细胞存活率;LrEVs可被HD11细胞有效内在化,并显著激活抗炎基因IL-10、TGF-β和促炎基因TNF-α、IL-1β的表达;LrEVs可显著抑制LPS激活的HD11细胞中NF-κB依赖性促炎基因TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,并增强抗炎基因IL-10和TGF-β的表达。与LrEVs预刺激的HD11细胞共培养后,LPS刺激肉鸡的脾脏淋巴细胞中抗炎基因IL-10和TGF-β的表达显著增加,且与免疫抑制相关的基因CD25、CTLA-4和LAG-3的表达也显著增加,而Th1型代表性细胞因子IFN-γ和Th17型代表性细胞因子IL-17的表达显著下降。PK和DR处理未能完全或大幅除去LrEVs中蛋白、DNA和RNA,但显著降低了它们的含量,这提示LrEVs携带的活性成分对外源酶具有一定的耐受性;在LPS刺激的空肠外植体中,与原生LrEVs相比,DR处理和PK处理显著降低LrEVs抑制促炎基因表达和增强抗炎基因表达的能力,表明这两种处理显著降低原生LrEVs对炎症反应的抑制活性。以上结果表明:LrEVs可被鸡巨噬细胞内在化并诱导先天免疫反应,同时对LPS诱导鸡巨噬细胞的炎症反应具有抑制作用;LrEVs可通过巨噬细胞增强脾脏淋巴细胞介导的抗炎作用,进而发挥适应性抗炎免疫调控作用;囊泡蛋白和核酸均参与LrEVs介导的抗炎免疫调控过程。综上所述,本研究从鸡肠道中筛选出一株益生特性好、免疫活性强的益生菌L.reuteri BBC3,证实它可产生并分泌含有母细菌活性成分的胞外囊泡,并证明这些囊泡可重现该菌株对肉鸡肠道炎症的保护作用;进一步阐明它们可通过抑制巨噬细胞参与的炎症反应和增强脾脏淋巴细胞参与的抗炎反应而维持免疫稳态,且囊泡蛋白和核酸均参与LrEVs介导的免疫调控过程。这些结果为筛选鸡用益生菌提供理论依据,并为明晰益生菌-宿主间交流通讯的潜在机制提供新见解。