腺苷生产菌的基因工程改造及其腺苷磷酸化酶基因的克隆和表达

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腺苷生产菌Bacillussp.ATCC21616发酵过程中腺嘌呤有积累,为了提高腺苷的产量,试图阻断腺苷分解为腺嘌吟的途径。查到deoD基因编码的腺苷磷酸化酶专一性催化腺苷分解为腺嘌呤的反应,PCR扩增此基因,测序表明与Bacillussubtilis168同一基因相似性为98.7﹪。deoD与整合型质粒载体pBGSC6连接,构建出重组质粒pBGSC6-deoD,转化Bacillussp.ATCC21616,希望通过同源重组,质粒整合到宿主deoD的相应位置,破坏宿主这一基因,从而阻断腺苷磷酸化酶的生成,使腺苷无法分解为腺嘌呤。但是,尝试了感受态法、电穿孔法、原生质体转化法,转化均未获得成功。Bacillussp.ATCC21616菌之前没有经过任何基因工程改造,遗传背景也不太清楚,推测质粒无法进入细胞,或者可以进入细胞,但是被胞内一些未知的酶给修饰或限制了。 另一方面,将deoD与pET28a(+)连接,构建出重组质粒pETdeoD,转化表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3),产物腺苷磷酸化酶以胞内可溶形式表达,HPLC测定酶活为87.0U。优化表达条件,即诱导前培养100min(OD550=0.6),然后添加0.05mMIPTG诱导4hr,表达量达到最大。同时研究了此酶的一些特性,最适pH是7.0,最适温度是34℃,4℃保存25天酶活基本不变,在50℃时不稳定。利用表达产物上的六聚组氨酸标签,用Ni2+金属螯合亲和层析纯化出目标蛋白,回收率达到90﹪以上。
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