《素问·六节藏象论》提到“肝者,罴极之本,魂之居也,其华在爪,其充在筋,以生气血”,王冰注曰:“东方为发生之始,故以生血气也”。表明肝脏可能是血气发生之所,而现代研究发现4～6月孕龄人胎肝不仅担负着物质代谢、蛋白质分泌等部分成熟肝脏的功能,还是胚胎重要的造血器官,造血、免疫系统干祖细胞的主要来源。胎肝移植曾被广泛应用于治疗多类疾病(如放化疗肿瘤病人造血衰竭、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等)并取得显著疗效,表明其中存在大量与造血相关的活性成分。 蛋白质是生命活动的最终体现者,担负着各项生理生化功能。蛋白质组技术作为一种可以规模化发掘生物体内蛋白质信息手段,已为世界各国实验室所关注,并取得了很大进展。因此采用蛋白质组学研究手段系统发掘胎肝内蛋白质信息将有助于从微观水平了解胎肝的造血功能。 由于20周孕龄在时间上处于4～6月孕龄的中间,而且20周孕龄人胎肝临床标本较易得到,所以我们采用20周孕龄人胎肝进行研究。本研究依次从组织和细胞层面对20周孕龄人胎肝的发育程度和蛋白质信息进行探讨。我们先在组织层次上从形态学角度阐述20周孕龄人胎肝的发育程度,以便对所提取的蛋白质组成成分进行功能分析,所采用的技术手段是HE染色。HE染色是最常用的组织化学染色方法,可以检测组织和细胞基本形态结构,实验结果说明20周孕龄人胎肝组织肝小叶和肝细胞板已基本形成,肝小叶之间可见初级和次级汇管区,肝细胞索呈单行或双行排列,肝窦内充满不成熟的造血细胞。肝细胞索内肝实质细胞形态大小较均一,细胞核染色较浅、核质疏松,细胞浆较多,胎肝内肝实质细胞形似成熟肝实质细胞而体积较成人肝肝实质细胞小;肝窦内造血细胞尚处于不成熟的状态,细胞形态大小不一致,细胞核染色较深、致密,细胞浆较少,并可见大量有核红细胞。可见20周孕龄人胎肝是处于发育中期的器官。 其次,我们对 20 周孕龄的人胎肝肝实质细胞进行提取和细胞内全部表达的蛋白质进行分离,以了解胎肝细胞内所表达的蛋白质的信息。器官的生物学功能是通过不同细胞在不同生理和病理条件下所发挥其特有的生物学效应而实现的,细胞是执行器官功能的基本单位;而蛋白质是生命活动的最终体现者,根据细胞的发育和生理状态蛋白质表达不停的变化,因此对细胞内的蛋白质进行分析有利于阐述器官的生物学功能。鉴于肝实质细胞是肝内唯一的实质细胞,胎肝内肝实质细胞不仅仅承担了肝脏的大部分代谢功能,还参与形成适合于造血细胞发育的造血微环境,我们提取了胎肝内肝实质细胞以分析其内的蛋白质信息。 肝实质细胞提取过程中,肝实质细胞易破碎和纯度较低是研究的瓶颈,我们构建了以冷冻凝集为基础的肝实质细胞提取技术平台,使提取的肝实质细胞的纯度达到95.3%。为了分析肝实质细胞内全部蛋白质信息,我们采用了二维电泳技术将肝实质细胞内全部蛋白质进行分离,并通过优化肝实质细胞裂解方法、凝胶制备方法、一向等电聚焦和二向SDS-PAGE凝胶电泳参数及染色方法,取得了较好的二维电泳图谱,二维电泳图谱的重复性达到83%。用PDQUEST软件分析蛋白质凝胶电泳上的蛋白质点数为 809±36 个,从蛋白质点的分子量分布范围来分析,分子量从 100kD 至约 1kD区域均有蛋白质点的分布,蛋白质点的分布在 20～100kD较密,低于 20kD较少。从蛋白质点的等电点分布范围来分析,蛋白质点在pH5～2 人胎肝肝实质细胞二维电泳和中医肝脏功能理论探讨9 分布较密集。本研究补充了现有胎肝蛋白质组资料,为下一步蛋白质鉴定做好了前期的准备工作,为发掘胎肝内新蛋白质和造血相关蛋白质及研究胎肝生血和肝藏血功能奠定了良好的基础。另外,通过大量古今文献调研,从宏观和微观、中西医结合的角度对中医肝脏的功能进行探讨,我们认为肝脏具有五大生理功能:主疏泄、主藏血、藏神与魂、调节水液和生血 。 关键词:人胎肝 二维电泳 肝实质细胞提取 肝藏血 肝脏功能 HE 染色