研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性流行,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。我国HBV感染率较高,1-59岁人群的HBsAg阳性率为7.18%,慢性HBV感染严重危害着我国人民的健康。抗HBV治疗是慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)治疗的关键,拉米夫定(lamivudine, LAM)是最常用的抗HBV药物之一,它能有效抑制HBV复制,减少肝脏的炎症活动,延缓或阻止肝脏疾病的进展,减少肝癌的发生率。然而,长期的LAM治疗会筛选出YMDD变异株(rtM204V/I/S),从而产生了LAM的耐药。阿德福韦酯(adefovir dipvoxil, ADV)是阿德福韦的前体口服药物,除了可以有效地抑制HBV野生毒株复制,体内和体外研究都证实阿德福韦可以有效地抑制YMDD变异株的复制,因而被广泛应用于LAM耐药患者的救援治疗。聚乙二醇干扰素a-2a(派罗欣,Pegasys)是一种长效干扰素,它的半衰期长,一周一次的给药可以提高治疗末应答和持久应答率,优于传统干扰素,是LAM耐药患者救援治疗的一个可能选择。研究表明,使用ADV单药治疗后,LAM耐药患者体内的YMDD变异株会逐渐消失,野生株逐渐取代YMDD变异株成为HBV准种中的优势株。使用派罗欣治疗后LAM耐药患者体内的YMDD变异株将如何变化,目前尚无相关报道。研究目的：1、探讨派罗欣治疗后YMDD变异株的动态变化,比较派罗欣及ADV作用下YMDD变异株动态变化之间的差异。2、探索停止LAM治疗后YMDD变异株的演化情况及YMDD变异株的演化与抗HBV疗效之间的关系。3、比较ADV单药和联合LAM治疗LAM耐药患者的临床疗效,为选择合适的抗HBV方案对LAM耐药患者进行救援治疗提供线索。研究方法：1.停止LAM治疗后YMDD变异的逆转：1.1样本来源：所有患者均来自2005年到2008年间我科参加的ML18376临床试验：LAM耐药HBeAg阳性CHB患者以2：1的比例随机分配到A(PEG组)、B(ADV组)两组,我科两组入组患者分别为25例、15例。A组患者给予Pegasys180μg 1/周治疗48周,停药后随防24周；B组患者给予ADV1Omg/d治疗72周；所有患者在头12周内均联合使用LAM1OOmg/d治疗。1.2 HBV DNA抽提：收集患者12周、16周、24周、48周、72周等时间点的系列血清,用DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)从血清(每个血清样本使用量为200μl)中提取HBV DNA。1.3 HBV RT区的PCR扩增：使用巢式PCR扩增HBV RT区,第二轮PCR产物直接送上海英骏公司测序。1.4测序结果分析：测序结果与Gen-Bank报道的A-G基因型别的HBV序列进行同源性比对,用HBV S区做进化树来进行基因分型。序列比对用MEGA4软件进行,测序峰图用Chromas软件分析。1.5统计分析：所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析,率的比较用χ2检验分析。所有结果均采用双侧检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。2.停止LAM治疗后YMDD变异株的克隆演化：2.1样本来源：所有4位患者均来自ML18376临床试验。2.2 HBV DNA抽提、HBV RT区的扩增：同前,扩增产物用胶回收试剂盒进行回收,回收产物一部分送上海英骏公司测序,一部分用于下一步实验。2.3 HBV RT区的克隆分析：将PCR纯化产物与pMDTM19-T Vector连接后转化JM109感受态细胞,转化产物在含有Ampicillin、IPTG、X-Gal的LB平板上进行蓝白斑筛选。每个血清样品随机挑选30个白色克隆在LB培养基中37℃225rpm振荡培养6至8小时。经PCR鉴定后将所有阳性菌液送上海英骏公司测序,最终有来自18个血清样本的370个克隆成功测序。3、阿德福韦酯单药和联合LAM治疗LAM耐药HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效比较：对24例ADV单药及28例ADV联合LAM治疗的LAM耐药HBeAg阳性慢性乙型肝炎进行回顾性分析,比较两组患者在HBV DNA、ALT水平及HBV DNA检测不到率、ALT复常率上的差异。结果：1.停止LAM治疗后YMDD变异的逆转1.1停止LAM治疗时HBV序列特点：1.1.1 YMDD变异株常伴有补偿变异入组本研究的患者中,伴有rtL80V/I、rtL180M或rtL80V/I+rtL180M等变异的患者共有36人,占所有患者的90%。1.1.2 YIDD与YVDD在补偿变异位点选择上存在明显差异YIDD伴rtL80变异的有17人,伴rtL180变异的有9人；YVDD伴rtL80变异的为7人,伴rtL180变异的是15人,两组比较具有显著性差异(χ2=5.371,P=0.02)。1.2停止LAM治疗后,YMDD变异株逐渐被野生株取代而发生逆转在某一时间点,直接测序法检测HBV为野生株时,我们就认为该患者体内的YMDD变异发生了逆转。停止LAM治疗4、12、36、60周后患者的YMDD变异逆转率分别为：72.5%(29/40)、80%(32/40)、87.5%(35/40)、95%(38/40)。1.3治疗方法对YMDD变异逆转无明显影响停止LAM治疗4、12、36、60周时PEG组的YMDD变异逆转发生率为：68.0%(17/25)、76.0%(19/25)、84.0%(21/25)、96.0%(24/25),ADV组分别为：80.0%(12/15)、86.7%(13/15)、93.3%(14/15)、93.3%(14/15),两组的YMDD变异逆转发生率同期比较均无显著性差异(P值分别为：0.309、0.685、0.633、1.000)。1.4 YIDD与YVDD在YMDD变异逆转上无明显差异12周时,YIDD、YVDD变异株感染者分别为24、16例。停止LAM治疗4、12、36、60周时YIDD组的YMDD变异逆转发生率为：66.7%(16/24)、79.2%(19/24),83.3%(20/24)、91.7%(22/24),YVDD组分别为：81.3%(13/16)、81.3%(13/16)、93.8%(15/16)、100%(16/16),两组的YMDD变异逆转发生率同期比较均无显著性差异(P值分别为：0.473、1.000、0.631、0.508)。1.5 rtL180M对YMDD变异逆转的影响按12周测序结果将所有患者分为rtL180M变异株感染组及rtL 180野生株感染组,两组分别为25例、15例。停止LAM治疗4周时rtL180M变异株感染组的YMDD变异逆转发生率显著低于rtL180野生株感染组(60.0%(15/25)VS93.3%(14/15),P=0.03)；停药12、36、60周时rtL180M变异株感染组的YMDD变异逆转发生率均低于rtL180野生株感染组,但同期比较两组间差异均无显著意义(72.0%(18/25)、80.0%(20/25)、92.0%(23/25)VS 93.3%(14/15)、100%(15/15)、100%(15/15),两组比较P值分别为：0.219、0.137、0.519)。1.6 rtL80V/I、rtL180M、rtM204V/I三重突变组与其他组在YMDD变异逆转上的差异按12周测序结果将所有患者分为三重突变组及其他组,两组分别为14例、26例。停止LAM治疗12、36周时,三重突变组的YMDD变异逆转发生率要显著低于其他组(57.1%(8/14)、64.3%(9/14)VS 92.3%(24/26)、100%(26/26),两组比较P值分别为0.014、0.003)；停药4周、60周时,三重突变组的YMDD变异逆转发生率要低于其他组,但同期比较两组间差异均无显著意义(57.1%(8/14)、85.7%(12/14)VS 80.7%(21/26)、100%(26/26),两组比较P值分别为0.147、0.117)。1.7YMDD变异与补偿变异的同步逆转现象停止LAM治疗以后,rtL80V/I、rtL180M等变异会随着YMDD变异的逆转而发生逆转,表现为其变异株感染人数同YMDD变异株感染人数的同步减少。2.停止LAM治疗后YMDD变异株的克隆演化1号患者出现耐药后给予Pegasys 180μg1/周治疗48周,其余3例患者均给予ADV1Omg/d治疗72周,所有患者在头12周均联合使用LAM1OOmg/d治疗。1号患者出现LAM临床耐药后用直接测序法检测到的HBV耐药突变为L80V+L180M+M204I,该变异株在12、16、24、48、72周时分别占到了HBV准种中的87.5%(17/20)、91%(20/22)、95%(18/19)、70%(14/20)、64%(16/25)。随著LAM停药时间的延长,rt204位点的野生株(包括合并有L80V/I、L180M、L80V/I+L180M, wild type等变异模式)在病毒准种中的比例逐渐增加,在48、72周时分别达到了30%(6/20)、32%(8/25)。2号患者在12、16、24、48、72周时用直接测序法检测到的HBV突变均为L80I+L180M+M204I,该变异株始终为HBV准种中的优势株,其在HBV准种中的比例分别为47%(8/17)、67%(14/21)、87.5%(14/16)、77%(14/18)、57%(12/21)。72周时,我们用克隆测序法检测出了野生株,其在HBV准种中的比例为9.5%(2/21)。3号患者在12周时直接测序法检测到的HBV突变模式为：L80V+L180M+M204I,克隆分析显示该变异株在HBV准种中占到了81%(17/21)。16周时野生株已占到HBV准种中的绝大部分(94.7%,18/19)。在24、48、72周时,野生株在HBV准种所占比例分别为91%(20/22)、67%(14/21)、69%(15/22)。4号患者在12周时用直接测序法检测的HBV突变为L80I+L180M+M204I,克隆分析显示该变异株占HBV准种的68%(13/19)。16周时直接测序法检测仍为该变异株感染,由于体内出现了多种变异株,其在HBV准种中的比例下降至33.3%(9/27),24周时该变异株在HBV准种中的比例降至10%(2/20)。24周时直接测序法未检出YMDD变异株,克隆分析显示野生株占到了HBV准种中的70%(14/20)。48、72周时由于HBV DNA载量过低而未能扩增出目的片段。3.阿德福韦酯单药和联合LAM治疗LAM耐药HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效比较：两组患者在性别、年龄、治疗前的HBV DNA及ALT水平上均无显著性差异。两组的HBV DNA、ALT水平在治疗48周、72周时分别与同组治疗前比较均有明显降低(P<0.05)。治疗48周时,联合组的HBV DNA检测不到率高于单药组(50%VS 25%,P>0.05)；ALT复常率两组间无明显差别(67.9%VS 75%,P>0.05)。治疗72周时,联合组的HBV DNA检测不到率为68%,要显著高于单药组的33.3%(P<0.05)；联合组的ALT复常率为93%,显著高于单药组的70.8%(P<0.05)。结论：1、停止LAM治疗后,野生株在HBV准种中的比例会逐渐增加并最终取代YMDD变异株成为HBV准种中的优势株。2、大多数患者体内的YMDD变异株在停止LAM治疗4周后发生逆转,rtL80V/I、rtL180M等补偿变异能减慢YMDD变异逆转的发生。3、rtL80V/I、rtL180M、rtM204V/I三者通常连锁发生于同一HBV毒株上,且会在停止LAM治疗后同步逆转。4、ADV单药或联合LAM均是治疗LAM耐药HBeAg阳性CHB的有效方法,总体来说联合治疗的疗效要优于单药治疗。5、即使出现了LAM耐药,在后续的治疗中依然有必要联合使用LAM来抗HBV治疗,值得进一步探讨Pegasys联合LAM治疗LAM耐药患者的疗效和安全性。