大肠杆菌(Escherichia coli,coli)是泌乳动物临床型乳房炎的主要病因之一,可引起泌乳量减少、奶品质下降、治疗管理费用增加等问题,严重时可造成动物淘汰甚至死亡,给奶业生产带来巨大的经济损失。目前,奶牛场多依赖抗生素来预防和治疗干乳期或泌乳期动物的乳房炎,这不仅容易诱导产生耐药菌株,而且易造成乳制品中抗生素残留,对食品安全卫生构成潜在威胁。近年来,国家对抗生素在养殖业使用的控制日趋严格。因此,探讨使用非抗生素方法治疗乳房炎具有现实意义。前期研究表明,人参皂苷(Ginsenoside)Rg1可结合到小鼠细胞上的Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4,抑制大肠杆菌内毒素(Lipopolysacchrides,LPS)刺激巨噬细胞,从而下调炎症反应。本研究在此基础上,研究Rg1对山羊大肠杆菌内毒素性乳房炎的治疗作用,并探讨其作用机理。1.Rg1阻断LPS对奶山羊单核细胞作用目的:观察Rg1对LPS诱导的山羊外周血单核细胞炎症反应和氧化应激是否具有阻断作用。方法:1)分离山羊外周血单核细胞,将Rg1和单核细胞共培养,用免疫荧光法标记Rg1,观察Rg1在细胞内外的分布情况;2)将不同浓度Rg1与Alexa fluor 488-LPS和单核细胞共培养,用免疫荧光标记法观察在Rg1存在的情况下结合到单核细胞的LPS;3)将不同浓度Rg1与LPS和单核细胞共孵育,检测在Rg1存在的情况下LPS刺激细胞后肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)-α、白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6 IL-8、TLR4和细胞内核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-KB,NF-κB)mRNA表达水平,以及细胞培养液中前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)表达水平;4)将不同浓度Rg1与LPS和单核细胞共孵育后,检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量。结果:1)荧光显微镜下可见细胞内呈现红色荧光,表明Rg1能够在细胞内分布;2)荧光显微镜下可见,随着Rg1浓度的增加,标记LPS的绿色荧光逐渐减弱,推测一定浓度Rg1可干扰LPS与单核细胞的结合;3)在Rg1存在的情况下,单核细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2表达水平以及TLR4及NF-κB表达水平显著下调;4)在Rg1存在的情况下,单核细胞内的SOD水平显著升高而MDA的水平显著减少。因此,Rg1可显著抑制LPS对单核细胞的刺激,降低细胞内的氧化应激产物,提高细胞的抗氧化水平。2.Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎的治疗作用目的:观察人参皂苷Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎的治疗作用。方法:将9只泌乳期健康奶山羊随机平均分配至3组。组1,用LPS乳房内灌注,之后生理盐水静脉注射,作为模型对照组;组2,乳房内灌注相同剂量LPS后,颈静脉注射Rg1,作为治疗组;组3,用生理盐水乳房内灌注后再用生理盐水静脉注射,作为空白对照组。在乳房内灌注LPS后3、6、9、12、15、18、21、24、48和72 h,采集血样和奶样,检测泌乳量,用血细胞自动分析仪检测外周血白细胞(White blood cell,WBC)、中性粒细胞(Neutrophils,NEU)、淋巴细胞(Lymphocytes,LYM),血液自动生化分析仪检测血清总蛋白(Total protein,TP)、白蛋白(Albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLOB),乳成分分析仪检测乳糖,体细胞计数仪检测乳中体细胞数(Somatic cell count,SCC)和分光光度法检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-Beta-D-Glucosaminidase,NAGase)活性。LPS灌注后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、48和72 h,分别测量乳房围度,利用体温计和红外线成像仪检测直肠温度和乳房表面温度变化。结果:1)组1,模型对照组中奶山羊乳房内灌注LPS后,表现出抑郁、坐立不安,体温显著升高,直至10 h后恢复正常。LPS灌注后乳房围度增加,局部肿胀、发热、疼痛,泌乳量减少,直至96 h后恢复正常。乳成分检测结果表明,LPS灌注后乳糖含量显著下降,乳中SCC和NAGase活性则显著上升。血液检测结果表明,外周血WBC、NEU、LYM以及血清TP、ALB、GLOB含量在乳房炎山羊中减少。以上结果表明,乳房内灌注LPS可诱导奶山羊发生临床型乳房炎。根据血液和乳成分检测结果推测,LPS乳房灌注后产生乳房局部炎症反应,导致血液中大量白细胞向乳腺组织游走,同时由于血乳屏障受损,大量血清蛋白进入乳腺,造成外周血白细胞和血清总蛋白的减少、乳体细胞数的增加以及乳房肿胀。2)组2,Rg1治疗组中奶山羊乳房灌注LPS后,临床表现出抑郁,坐立不安等症状。经颈静脉注射Rg1后,乳房疼痛得到缓解,直肠和乳房表面温度下调,泌乳量回升,乳房围度增加趋势得到抑制,乳房肿胀停止。乳成分检测结果表明,Rg1给药后乳SCC以及NAGase活性减少,乳糖含量恢复。血液检测结果表明,给药后血液成分,包括WBC、NEU、LYM以及血清TP、ALB、GLOB,恢复正常水平。以上结果显示,人参皂苷Rg1静脉注射可缓解LPS性乳房炎,减轻奶山羊的全身和局部症状,使泌乳量和乳成分恢复。3)组3,空白对照组中奶山羊乳房灌注生理盐水后未见临床型乳房炎症状,经颈静脉注射生理盐水前后,除体温、乳房表面温度随室温略有变化外,乳房围度、外周血白细胞计数、血清蛋白含量、泌乳量、乳糖含量、SCC以及乳NAGase活性均无显著变化。3.Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎乳清蛋白组影响目的:探索人参皂苷Rg1对LPS诱导山羊乳房炎乳清蛋白质含量变化的影响。方法:乳房灌注后6 h,采集上述3组奶山羊的乳样,每组3只羊,每只羊各1份,共9份。经过脱脂、酪蛋白沉淀等步骤,制备乳清蛋白并分解成肽段。利用基于串联质量标签标记技术(Tandem mass tags,TMT)的定量蛋白质组学方法,进行乳清蛋白质组检测,分析各组之间的差异蛋白,并进行基因本体论(Gene ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集方面的信息学分析。结果:1)各组乳清蛋白样品均一性较好,经TMT方法上机检测后,共获得3838个不同肽段。利用Uniprot蛋白分析数据库中“Ruminantia”数据库对所检测到肽段进行分析,共鉴定得到乳清样品中791个蛋白,其中2段以上肽段覆盖蛋白占总蛋白数的69.5%,各样品蛋白丰度分布基本呈正态分布,主成分分析结果显示三组组内各样品差异较小。2)各组间蛋白含量统计学分析表明,组1与组3(空白对照组)之间共有98个差异蛋白。其中组1含量显著升高的蛋白是炎症因子,包括IL-6、急性期蛋白、凝血因子和补体蛋白等。同时ALB在组1中显著上调,表明LPS灌注引起乳房血乳屏障破坏。组2与组1之间共有34个差异蛋白。其中组2的ALB、IL-6等急性期反应相关蛋白显著下调,而真核翻译起始因子4B(Eukaryotic translation initiation factor 4B,EIF4B)、β-1,4-半乳糖基转移酶-I(Beta-1,4-galactosyltransferase I,B4GALT1),以及与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)相关蛋白表达水平上调,包括三叶因子2(Trefoil factor 2,TFF2)、脂肪酸转运蛋白(Fatty acid transporter,CD36)、脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid binding protein 5,FABP5)和金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP metallopeptidase inhibitor 2,TIMP2)等。这些蛋白与抑制炎性介质分泌、缓解LPS诱导的氧化应激水平上调、阻止细胞凋亡、保护血乳屏障完整性等方面有关。组2与组3样品比较,共获得差异蛋白53个。其中组2急性期反应蛋白显著上调。但差异蛋白聚类热图显示,组2各样品蛋白含量与组3更接近,提示Rg1静脉注射减弱了 LPS对奶山羊乳清蛋白含量的影响。3)GO富集分析发现,各组间差异蛋白主要被富集到的GO条目为对刺激物的反应(Responseto stimulus)。该条目富集到组1与组3间差异蛋白44个,表明LPS乳房灌注后,乳清蛋白质组主要差异蛋白富集在对刺激的反应上。该条目还富集到组2与组1间差异蛋白11个,以及组2与组3间差异蛋白20个。以上结果表明,Rg1静脉注射能下调内毒素诱导的山羊免疫应答反应,减少乳清蛋白质组的变化。4)KEGG通路富集分析结果显示,补体和血凝级联反应信号通路(Complement and coagulation cascades)富集到较多的差异表达蛋白,包括组1与组3间差异蛋白20个,均在LPS刺激后显著上升;组2与组1间差异蛋白4个,均在Rg1治疗后显著下降;组2与组3间差异蛋白10个,均在Rg1治疗后尚未恢复正常水平。该结果表明,LPS诱导奶山羊乳房炎后,机体补体系统被激活,从外周血进入乳腺,并在感染早期募集中性粒细胞和单核细胞至炎症部位,同时介导机体免疫细胞的杀伤等作用。Rg1静脉注射可下调LPS诱导的补体和血凝级联反应通路,抑制该通路诱导的促炎介质分泌和白细胞募集等作用。综上所述,人参皂苷Rg1可干扰LPS与单核细胞的结合,抑制IL-6等炎性细胞因子表达、下调TLR4/NF-KB信号通路、缓解LPS诱导的氧化损伤。静脉注射Rg1可抑制LPS诱导的乳房炎症肿胀、降低山羊的体温和乳房局部温度、下调乳SCC和NAGase活性、恢复泌乳量和乳糖含量、恢复外周血白细胞和血清总蛋白含量。乳清蛋白组学分析表明,Rg1静脉注射显著下调了 LPS诱导的急性期反应相关蛋白在乳清中的含量,增加与PPARy以及保护乳腺组织相关蛋白的表达水平。因此,Rg1静脉注射对LPS诱导的奶山羊乳房炎有治疗作用,可能与Rg1的抗炎和对乳腺的保护作用有关。临床上如何采用Rg1治疗反刍动物大肠杆菌性乳房炎值得进一步研究。