HRM技术在大豆异黄酮合成关键酶基因SNP分型中的研究应用

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大豆异黄酮是一种重要的大豆次生代谢产物,在治疗和预防心血管疾病、骨质疏松症以及癌症等领域都有极其显著的生物功效,同时对人体健康有非常重要的调节和保健功效。由于大豆异黄酮在不同栽培大豆品种中含量差异显著,所以研究大豆异黄酮通路中的相关酶类,解析异黄酮生物合成途径,对提高大豆中异黄酮的含量具有重要作用。SNP是一种位点丰富,遗传稳定性高的重要遗传标记,对于代谢通路中关键酶基因SNP的研究或许可以解答不同品种异黄酮含量差异的问题。本研究利用Ecotilling技术理论及高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析技术对256份栽培大豆中异黄酮合成代谢相关基因进行单核苷酸多态性(SNPs)的分型,主要的实验结果如下:(1)本研究提取了3000份栽培大豆基因组DNA,并对大规模基因组DNA提取方法进行了筛选和优化。比较多种基因组提取方法,最终确定CTAB法作为大豆叶片基因组DNA的提取方法。我们对3000份栽培大豆中的256份核心种质资源的大豆异黄酮含量进行了测定,以期为之后的SNP分型提供品种选择依据与表型数据。(2)本研究对256份栽培大豆品种的大豆异黄酮合酶基因(IFS1)的外显子区域进行SNP筛查,并采用直接测序的方法对HRM检测结果进行验证,以期建立一套严格准确的检测体系。结果表明:模板均一化后的检测效果较未均一化的检测效果显著,野生型样本与待测样本按1:1及1:4比例混样溶解曲线阈值较高,其中1:4混样适合高通量检测。利用此体系对IFS1基因第五段外显子和第七段外显子进行检测,准确率分别达到91.2%和100%。因此本研究利用HRM技术建立的栽培大豆的SNP分型体系,是一种准确可靠的新方法。(3)根据异黄酮含量测定的结果,选择5个异黄酮含量最高及5个异黄酮含量最低的品种,对其异黄酮合成代谢关键酶基因CHS8,CHI2,CHR,4CL,F3H进行测序,找到这些关键基因编码区的SNP位点,然后对256份栽培大豆核心种质的异黄酮合成相关基因的SNP进行分型。结果共找到7个SNP位点,并成功的利用HRM技术将其分型。根据检测结果将SNP进行分型,为实验室后续的关联分析工作做好理论准备,并进一步验证了该检测技术在大豆SNP分型中的可行性。
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