蛋白质天冬酰胺连接的糖基化(N-糖基化)是一种重要的蛋白质翻译后修饰途径。在真核生物中,N-糖基化修饰起始于内质网,首先在磷酸多萜醇上合成寡糖链,然后由寡糖基转移酶(Oligosaccharyltransferase,OST)将其转移至多肽中的糖基化位点NXS/T(X指脯氨酸以外的其他氨基酸,N为天冬酰胺,S为丝氨酸,T为苏氨酸)上,与天冬酰胺侧链氨基上的氮原子共价连接。OST是由4到8个亚基组成的寡聚膜蛋白复合体,其中高度保守的STT3亚基具有糖基转移酶活性。低等真核生物,如酵母的OST复合体含有唯一的STT3亚基。高等真核生物,如动物细胞表达两种OST复合体,按其转移酶活性亚基的不同分为STT3A复合体和STT3B复合体。STT3A与蛋白质转移通道相作用,在多肽延伸的同时将其糖基化,这与酵母中STT3功能相似。而靠近蛋白质两端或者含有半胱氨酸的糖基化位点容易被STT3A跳过。STT3B可以在STT3A跳过的糖基化位点处加上糖链,进一步提高细胞糖基化效率。诸多研究表明,STT3B有其独特的糖基化机制。STT3B功能相关的基因突变会导致诸多严重的基因疾病。我们对细胞内STT3B的功能和作用机制还缺乏全面的了解。为了构建STT3B依赖型N-寡糖转移相关基因的筛选细胞株,本研究通过定点突变在单体增强绿色荧光蛋白(mEGFP)不同位置引入糖基化位点构建可糖基化mEGFP(N-glycosylatable mEGFP,Ng-m EGFP)。并在其N端融合钙网织蛋白的信号肽序列,同时在其C端加上内质网滞留信号序列KDEL,从而将其定位到内质网。在人胚肾293(HEK293)细胞STT3A或者STT3B敲除的细胞株中表达Ng-m EGFP,通过流式细胞仪分析和蛋白质免疫印迹分析,筛选得到三个STT3B依赖型的糖基化突变体mEGFPQ185N,mEGFPK215T,mEGFPQ185N/N186C。这些突变体在STT3B敲除细胞株中无法被糖基化,且细胞荧光明显弱于野生型和STT3A敲除细胞株。我们将荧光差异最明显的mEGFPQ185N/N186C整合到HEK293细胞基因组上,筛选得到一株荧光对N-糖基化敏感的单细胞株。在该细胞株中敲除STT3B,基因敲除的混合细胞株出现两个EGFP信号峰。结果表明该细胞株在STT3B依赖型N-寡糖转移相关基因高通量筛选研究方面的应用潜力。