桑叶(Morus alba L.)是一种药食两用的植物。具有资源丰富、食用安全的特点。桑叶清蛋白(MP)作为桑叶蛋白的主要构成,具有良好的抗氧化活性。利用可控酶解技术制备的桑叶清蛋白酶解物(HMP)同样也具有很高的抗氧化活性。本文以桑叶清蛋白和酶解物为研究对象,研究两者的功能活性以及对肠道菌群的影响。首先利用静态体外模拟消化方法,对桑叶清蛋白和酶解物进行模拟胃肠消化,用SDS-PAGE分析消化前后的分子量变化,并对消化前后的蛋白和肽进行体外模拟发酵,分析其对肠道菌群组成及短链脂肪酸含量的影响。然后利用胎牛血清诱导的脂肪变性细胞模型初探模拟消化前后蛋白及肽的降脂活性。与此同时通过体外炎症细胞模型探究酶解物的抗炎活性,最后采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型评估酶解物的体内抗炎活性并分析肠道菌群在其中的作用。主要研究结果如下:1.通过静态体外模拟消化实验发现,MP在经过胃消化后分子大小为245k Da、70 k Da的两个亚基被降解,仅保留了分子量为55 k Da、10 k Da的两个亚基。在经过小肠消化后,桑叶清蛋白中分子量为55 k Da、10 k Da的亚基仍有部分保留。SDS-PAGE电泳结果显示酶解物的分子大小均小于10 k Da。以上结果表明MP在模拟胃肠消化后仅有部分被完全降解。2.探究模拟消化前后的桑叶清蛋白和酶解物对肠道菌群的影响及有机酸含量的变化。利用志愿者粪便样品作为接种物对桑叶清蛋白及酶解物进行体外发酵(采用Hungate tube法),研究结果发现:与空白组相比,SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)含量及支链脂肪酸BCFAs(异丁酸、异戊酸)含量均显著增加(p<0.05)。其中丁酸增量最为明显。发酵24 h后,与菊粉组相比,除DMP(桑叶清蛋白模拟消化产物)组外,其他组丁酸产量与菊粉组无显著性差异。其主要原因是桑叶清蛋白和酶解物中含量最高的谷氨酸被发酵产生丁酸。由于桑叶清蛋白和酶解物中支链氨基酸(Leu,Val,Ile)的存在,使得异丁酸和异戊酸含量高于空白组和菊粉组,且酶解物的支链氨基酸含量比桑叶清蛋白高,故发酵酶解物后产生的BCFA含量高。3.体外发酵后肠道菌群分析结果显示,(1)清蛋白和酶解物可以降低厚壁菌门与拟杆菌门之比(F/B),表明清蛋白和酶解物可能具有降脂的功能;(2)清蛋白和酶解物可以促进与抗炎相关的菌群(Phascolarctobacterium、Parabacteroides、Oscillospira)相对丰度的增加,这说明清蛋白和酶解物可能可以通过调节肠道菌群来达到抗炎的作用。此外利用q PCR对Akkermansia muciniphila的绝对定量实验发现未经模拟消化的酶解物可以促进其生长。以上结果说明桑叶清蛋白和清蛋白酶解物可能具有潜在的改善肥胖和抗炎的作用。4.利用胎牛血清(FBS)诱导的人肝细胞系LO2脂肪变性模型研究模拟胃和小肠消化前后的桑叶清蛋白和酶解物的降脂活性。研究表明:1000μg/m L MP、HMP、DHMP(HMP的胃肠消化产物)均能显著改善脂肪堆积、降低TG/TC含量,其中MP、DHMP效果最为显著,TG/TC含量表现出与空白组无显著性差异。说明MP、DHMP在此浓度具有很好的降脂活性。在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型实验中发现,不同浓度的HMP的抗炎效果不同,其中浓度为125μg/m L的HMP抗炎活性最优。5.采用结肠炎小鼠模型探究酶解物对结肠炎的缓解作用及对肠道菌群的调节作用。雄性C57BL/6小鼠灌胃HMP 14 d(第1-14 d,PHD组,预防性干预组)和7 d(第8-14 d,DPH组,治疗性干预组),并使用3%的葡聚糖硫酸钠(DSS)通过饮用水诱发急性结肠炎(第8-14 d)。结果表明,PHD组和DPH组均可增加饲料摄入量,缓解体重和结肠长度减少,降低结肠炎小鼠的DAI评分和组织学评分,减少杯状细胞耗竭和粘液破坏,抑制促炎性细胞因子,改善肠道菌群结构(提高肠道菌群的α多样性、缓解F/B值的失调、增加有益菌Lactobacillus的相对丰度、降低有害菌Escherichia-Shigella的相对丰度)及增加SCFA的产生。此外,在炎症发作期间,与DPH相比,PHD在促进杯状细胞成熟和增加粘蛋白分泌方面更有效。但是,DPH增加了肠道菌群α多样性。总之,HMP可通过抑制促炎细胞因子,改善粘膜屏障和调节肠道菌群来缓解DSS诱导的结肠炎。此外,预防性干预效果优于治疗性干预。这些结果表明HMP可能是一种新颖且有吸引力的膳食干预剂,其可以减轻患有肠炎的患者的病症。