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凝集素作为自然状态下存在的一类能够与不同糖结构特异性结合的蛋白质,在细胞的糖基化分析方面具有其天然优势。本研究旨在构建一种人凝集素芯片,并初步应用于肿瘤细胞迁移与人凝集素之间关系的研究。本研究将从系统层次研究人凝集素的功能,加深对凝集素与糖蛋白相互作用的认识,为筛选抗癌药物提供靶分子,为癌症的防治提供有效手段。 本研究首先搜集106个人体内凝集素蛋白的编码序列,在已有的人凝集素Entryclone的基础上,采用Gateway克隆技术通过LR反应将其连接到pEGH-A表达载体中,然后导入酵母表达系统中进行过量表达;酵母细胞经过半乳糖诱导表达重组蛋白后,向收集到的菌体中加入锆珠进行震荡裂解、再利用谷胱甘肽亲和介质富集带有GST标签的凝集素蛋白,采用一步法裂解纯化可以充分提高膜蛋白的产率并保持其活性。得到的酵母表达库共有两个来源,主要来源是实验室有一套人蛋白酵母表达库,跟数据库匹配得到69个,能够成功表达的有51个;从原始Entryclone导入表达系统中的有24个,其中,能够成功表达重组蛋白的有23个。 比较不同基片后,选择信号强度及信噪比等各方面综合效果最好的PSH‐OP基片来构建人凝集素芯片,每张芯片设计12个相同的区域,每个区域设计成13行、18列的矩阵,排布着74个凝集素蛋白,2个阴性对照,1个阳性对照,最后通过质控证明芯片上的蛋白点全部有效。 利用人凝集素芯片,根据已建立好的标准流程来分析三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)及其不同转移能力及器官嗜性的衍生细胞系(SCP4,SCP6,SCP28以及4175)表面的糖链信息,找到6种特征性的糖特异性结合的凝集素(GalNAc-T6、galectin-1、galectin-2、galectin-7、galectin-8、ERGIC-53),可进一步应用于乳腺癌的研究。 本研究将筛选得到的克隆表达序列通过Gateway技术构建重组蛋白表达系统,经过蛋白分离纯化后,构建了一款人凝集素芯片,并应用到乳腺癌细胞表面糖链结构的分析,对乳腺癌的早期检测具有一定的理论意义和实际应用价值。