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目的缺血性脑卒中已成为危害人类生命健康的重要疾病之一,而糖尿病患者发生缺血性脑卒中的风险较非糖尿病患者明显增加,并且很多研究均证实糖尿病可加重缺血性脑卒中的病情及增加死亡率。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)来源于骨髓干细胞,存在于外周血,成熟分化后变成内皮细胞,对血管内皮的损伤具有修复作用,并可在缺血组织的血管新生中起重要的作用。然而,外周血EPCs在脑卒中发生后外周血中的改变情况,以及合并有糖尿病等高危因素时的改变情况尚无定论,以及外周血EPCs数量改变与卒中病情之间的关系有待进一步明确,且卒中对外周血EPCs数量的调控机制尚不明确。为此,本实验应用正常大鼠和由1%链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)溶液诱导的糖尿病大鼠,在不合并或合并局灶性脑缺血再灌注损伤的情况下,比较大鼠外周血EPCs数量的变化、脑组织损伤情况、及脑组织中VEGF、bFGF和eNOS表达；旨在探讨正常和糖尿病大鼠发生局灶性脑缺血再灌注损伤后外周血内皮祖细胞数量变化及其意义和机制,为缺血性脑卒中的防治提供理论依据。方法(1)将健康成年雄性SD大鼠100只,随机分为正常对照组(10只)、假手术组(10只)、脑缺血再灌注模型组(CIR组,30只)、糖尿病模型组(10只)、糖尿病假手术组(10只)和糖尿病合并CIR组(30只)。用1%STZ溶液,按照65mg/Kg给空腹大鼠单次左小腹腔注射复制1型糖尿病动物模型。采用线栓法阻塞左侧大脑中动脉建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。(2)再灌注24 h后采用Longa5分制评分标准对各组大鼠进行神经行为学评分(neurologic deficit score,NDS)。(3)再灌注24h后,各组大鼠麻醉成功后,眼眶静脉取血,抗凝后行流式细胞仪技术测定外周血EPCs数量。(4)再灌注24h后,每组各取5只大鼠,麻醉成功后断头取脑,取新鲜脑组织切成2mm厚脑片放入1%浓度2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC)溶液中染色,计算脑梗死体积。(5)其余大鼠于再灌注24h后10%水合氯醛腹腔麻醉成功后,左心室插管,4%多聚甲醛灌流,断头取脑,固定,浸蜡,包埋,连续切片,采用免疫组化方法分析脑组织中VEGF、bFGF和eNOS阳性表达的分布和变化规律。(6)采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。统计处理多组间比较采用方差分析,2组均数间比较采用q检验,取P<0.05作为显著性检验标准。结果(1)正常大鼠和糖尿病大鼠的一般情况糖尿病大鼠出现明显的多饮、多食、多尿及体重减轻等糖尿病的典型症状,造模成功后,糖尿病模型组大鼠质量[(196.7±8.6)g]明显低于正常对照组[(250.8±17.7)g]；其血糖[(32.2±6.4) mmol/L]明显高于正常对照组[(4.4±0.7) mmol/L] (P＜0.01)。(2)各组大鼠NDS评分正常对照组、假手术组、糖尿病模型组、糖尿病假手术组均未见明显神经功能损害,NDS评分均为0分,糖尿病合并CIR组神经功能评分[(2.8±1.0)分]明显高于CIR模型组[(1.5±0.3)分](P<0.05)。(3)各组大鼠脑组织TTC染色结果非梗死区脑组织被染成红色,梗死区呈现白色,且梗死区与大脑中动脉供血分布区域相一致。糖尿病合并CIR组脑梗死体积为[(464.1±169.3)mm3]明显大于CIR模型组[(101.3±57.4)mm3],两组差异有统计学意义(P<0.01)。(4)外周血EPCs数量与正常对照组及假手术组比较,CIR模型组大鼠外周血EPCs数量明显增加,糖尿病模型组、糖尿病假手术组及糖尿病合并CIR组大鼠外周血EPCs数量明显减少；与糖尿病模型组比较,糖尿病合并CIR组大鼠外周血EPCs数量明显减少(均P<0.01)。(5)脑组织免疫组化结果与正常空白对照组和假手术组比较,CIR组脑组织中神经元、神经胶质细胞表达的VEGF、星形细胞和内皮细胞表达的bFGF,以及内皮细胞表达的eNOS含量明显增加；糖尿病空白对照组和糖尿病假手术组相应细胞无明显着色；糖尿病合并CIR组VEGF、bFGF和eNOS含量略高于糖尿病空白对照组和糖尿病假手术组(均P<0.01)。结论(1)CIR组大鼠外周血EPCs数量增加,有助于修复血管及保护受损脑组织。(2)糖尿病大鼠外周血EPCs数量明显减少,且合并CIR后减少更甚。(3)外周血EPCs数量的检测可能有助于CIR病情及预后的评估。(4)正常大鼠发生急性脑梗死后,脑组织合成大量的VEGF、bFGF和eNOS,促进骨髓中的EPCs动员至外周血,增强血管发生保护缺血损伤脑组织。(5)糖尿病大鼠外周血EPCs数量明显降低可能与脑组织中VEGF、bFGF和eNOS含量减少有关；糖尿病大鼠发生局灶性脑缺血再灌注损伤后,虽然脑组织VEGF、bFGF和eNOS的含量轻度增高,但外周血EPCs数量明显减少,其机制可能不完全与糖尿病损伤动员EPCs能力有关。