研究背景与目的肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cnacer,NSCLC）是最常见分型，其死亡率高且近年来呈现上升趋势。超过50%的NSCLC患者在确诊前病情已有明显进展及转移。化疗在NSCLC临床治疗中发挥了重要作用，但在实际临床应用中的疗效仍不其5年的平均生存率都仅为13-20%，化疗药物耐药性的产生是其失败的主要原因，因此对于肺癌耐药机制的深入探讨仍然是被关注的研究领域。以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可竞争细胞表面的表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR-TK）催化区域上的ATP结合点，从而抑制EGFR的磷酸化及下游信号通路的激活，已被FDA批准用于晚期非小细胞肺癌（NSCLC）经化疗后继续恶化者的单用治疗的有效药物。吉非替尼作为一种靶向药物在改善晚期非小细胞肺癌疗效和生活质量方面表现出了一定优势，尤其是对具有EGFR激活性突变（外显子19缺失及外显子21号L858R突变）的患者，在治疗中更具有优势。但随着进一步的治疗，最终都会不可避免的出现耐药现象，导致病情的复发及进一步进展。而且，研究表明存在活性突变与药物应答之间的联系并不是十分确定，一些病人初期有效却极易发生耐药，说明仍然存在其他机制参与对吉非替尼的应答反应。因此，阐明影响吉非替尼在治疗过程中产生耐药的因素及机制，从而发现和探讨联合用药的抑制耐药产生的方法，对于更好的促进吉非替尼作用疗效，从而一步提高肺癌患者的生存期，具有重要的意义与价值。在研究中发现，肿瘤细胞抵抗抗肿瘤药物引起的凋亡的机制复杂多样，这些机制中，一大部分是由于肿瘤细胞获得了促进细胞存活的基因突变。然而，一般需要通过较长的时间才能获得这些抗药基因型，那么在最终产生耐药基因型之前，就需要有能够给细胞提供持续的免受药物损伤的非基因突变性保护机制。因此我们推断，一些暂时的或持续性的耐药机制在药物治疗早期就已经开始发挥作用。目前的研究普遍认为，肿瘤的产生并不仅仅局限于肿瘤细胞因自身某些基因异常表达呈现高增殖性和迁移性的细胞，还包括与肿瘤细胞相互作用的由宿主成纤维细胞、内皮细胞及免疫细胞等构成的肿瘤微环境。它们通过彼此之间的相互作用来决定肿瘤细胞的命运，也包括肿瘤细胞对药物的应答反应。肿瘤微环境中细胞所释放的细胞因子能够诱导肿瘤细胞基因转录或者激活转录后的修饰，从而降低其对药物的敏感性，而这一耐药机制具有短暂性和可逆转性，因此以这些环境中的因子为靶点将有可能提供一种最大程度消灭微小残留病灶的有效方式，阻断微环境介导的耐药将可能防止复发或延长发生复发的时间。在肺癌组织细胞微环境中，成纤维细胞普遍存在，可表达分泌大量与肿瘤细胞增殖存活相关的细胞因子及基质成分，因此，本研究旨在研究成纤维细胞对吉非替尼敏感型NSCLC细胞系HCC827的影响，并对可能存在的相关机制进行探讨，以期能够在靶向治疗早期阻断微环境介导的耐药，从而最大程度防止复发或延长发生复发的时间，提高患者的生存期。研究内容与方法第一部分肺癌细胞HCC827与成纤维细胞共培养对吉非替尼敏感性的影响从肿瘤组织标本中成功分离了原代成纤维细胞，并通过测定标志物Vimentin对其进行了鉴定。采用Transwell技术研究了原代成纤维细胞及成纤维细胞株MRC-5对敏感型NSCLC细胞系HCC827吉非替尼应答的影响。MTT法观察吉非替尼作用时肿瘤细胞的增殖率变化，我们发现在与NSCLC细胞株HCC827共培养条件下，两种成纤维细胞均能减弱吉非替尼对肿瘤细胞增殖的抑制作用（30%，P<0.05）。对肿瘤细胞和成纤维细胞预先进行相互诱导共培养后对这种保护机制的影响进行研究发现，48h内的预共培养，并没有发现对肿瘤细胞吉非替尼敏感性有明显影响。第二部分共培养条件下HCC827细胞对吉非替尼敏感性降低的机制初探吉非替尼抗肿瘤作用的主要机制是通过抑制EGFR的磷酸化从而阻断下游促进肿瘤细胞生长信号的传递。本实验通过流式细胞技术观察单独培养及共培养条件下吉非替尼对肿瘤细胞株HCC827的凋亡及周期的影响。通过流式细胞技术分析结果发现，共培养条件下吉非替尼对肿瘤细胞株HCC827促凋亡率比较单培养条件下减少了20%左右（P<0.05）；且在共培养条件下吉非替尼阻滞肿瘤细胞株HCC827于G0/G1期的比例比较单培养条件下有一定降低。Western blotting分析证实肿瘤细胞在与成纤维细胞共培养后，虽然EGFR的磷酸化状态仍然受到抑制，但EGFR下游p-Akt和p-ERK的表达水平均有升高，因此我们推断成纤维细胞引起肿瘤细胞对吉非替尼反应性降低很可能是由于下游信号蛋白被旁路信号激活所致，从而促进了肿瘤细胞的存活，减少了药物诱导的凋亡和细胞周期的抑制。而MET基因扩增是报道比较多的引起耐药的机制之一，因此本实验还对共培养条件下MET的表达水平进行了测定，发现MET基因扩增并不是共培养条件下肿瘤细胞对吉非替尼敏感性降低的主要机制。另外，在本实验中还观察了成纤维细胞MRC-5的培养介质在介导肿瘤细胞对吉非替尼敏感性的影响，发现成纤维细胞固有分泌的可溶性因子可引起肿瘤细胞对药物的敏感性降低，因此我们推断是成纤维细胞分泌的可溶性因子参与了EGFR信号被阻断后其下游通路的旁路激活。第三部分共培养及吉非替尼处理条件下HCC827差异表达基因的筛选及生物信息学分析为了研究成纤维细胞可溶性因子参与肿瘤细胞对吉非替尼敏感性降低的机制，我们采用Affymetrix Primeview全基因组表达谱芯片筛选了四组共培养及吉非替尼处理对肿瘤细胞HCC827中差异表达的基因，从而较为全面的对共培养及单独培养条件下肿瘤细胞对吉非替尼不同应答情况的内在机制。对基因芯片结果进行高通量的分析发现，细胞在单独培养条件下及共培养条件下加入吉非替尼后发生表达变化的差异基因约有642个（4vs2组）。通过GO分析和Pathway分析我们发现，这些基因涉及广泛的功能包括细胞周期调节、细胞生长、凋亡、信号转导等；以及广泛的信号通路如MAPK、P53、细胞周期、黏着斑、Wnt通路和TGF-beta通路等。这些结果有助于全局了解不同培养条件下肿瘤细胞对吉非替尼的应答机制，通过文献查询及对差异基因的功能归类，我们初筛了8个用于进一步研究的基因，主要为IGFBP1、AURKB、FGFBP1、AURKA、VEGFA、EMP1、ITGA2、TP53。而它们是否为参与药物应答不同反应的重要应答基因及在通路的作用机制仍有待于进一步实验研究。第四部分相关差异基因的验证及AURKA过表达对HCC827吉非替尼敏感性的影响为了研究在细胞有丝分裂的正常进行中发挥作用的AURKA基因是否参与单培养及共培养条件下的不同应答机制进行研究，我们通过构建aurora-A的过表达质粒，转染HCC827后再对吉非替尼的敏感性进行测定，从而分析其在共培养条件下是否引起肿瘤细胞对吉非替尼敏感性降低。结果表明，AURKA过表达能够在一定程度上降低对吉非替尼的敏感性，但仍需要进一步的RNA干扰来进行验证。