正常情况下机体的氧化能力和抗氧化能力处于动态平衡中。但是,机体受到外界各种刺激后会发生一系列非特异性防御反应来抵抗和适应这些刺激,当机体细胞内产生的自由基的水平高于其抗氧化防御能力时,过量的自由基存在于组织或细胞内,就会引起氧化还原状态失衡,诱发氧化应激,并导致氧化损伤。氧化应激是人类范围极广的综合病症的主要原因之一。肠道作为机体器官中与外界接触面积最大的器官,寄居着大量的微生物,承载着食物消化、吸收和代谢的主要功能。所以,肠道中存在着非常活跃的物质和能量代谢,极易被氧自由基攻击。更严重的是,氧化应激会逐渐缓慢地给肠道带来非常严重的损伤。所以,维持氧化还原平衡对维持肠道内环境平衡至关重要。有报道表明益生菌能够改变肠道内的微生物结构,从而构建肠道内有利于消炎的环境,起到降低促炎细菌繁殖,并改善肠道屏障的完整性的作用,甚至某些益生菌还被证明可以降低肠道氧化应激程度。尿液采集简单方便,是非侵入性检测最常用的生物样品。肠道菌群代谢物可通过吸收后排泄进入尿液并在膀胱中积累,能够反映身体的最终变化,可以在设定的时间段内汇集和收集。所以,尿液是机体代谢的“集中营”,也是机体疾病的“晴雨表”。所以,本文利用本课题组创立的纳米纤维固相萃取技术建立了人尿液样本中谷胱甘肽等氧化应激标志物和吲哚胺类肠道菌群代谢物的检测方法,并且设计了不同应激模式的人群研究范式,通过对人体无创样本中氧化应激生物标志物和肠道菌群代谢物吲哚类物质的检测,研究人体氧化应激对肠道菌群代谢的影响。此外,利用静电纺丝技术制备新的复合纳米纤维材料作为乳酸菌包埋材料,并进行体外实验考察了其对益生菌活性的保护作用。具体内容如下:一、氧化应激标志物和肠道微生物代谢物检测方法建立(1)使用静电纺丝技术制备PS-CuNPs复合纳米纤维,,基于纳米铜与谷胱甘肽的活性基团-SH形成Cu-S共价键的原理,实现了衍生反应前对尿样中谷胱甘肽选择性提取。谷胱甘肽的标准曲线在浓度为10至1000 ng/mL范围内都表现出了良好的线性(R~2≥0.99)。LOD和LOQ的值分别是1.1 ng/mL和3.7 ng/mL。对于低、中和高浓度的人工尿液样品来说,回收率范围为94.6%-95.7%,表明尿样中谷胱甘肽的回收率良好。日内精度和日间精度均小于10%,符合生物样品的试验要求。同时将建立的检测方法应用到高危婴儿和正常婴儿的尿液中GSH的检测中,结果发现,正常儿童尿中谷胱甘肽的平均水平为823±220 ng/mL,高危婴儿尿中谷胱甘肽的平均水平为443±150 ng/mL,高危婴儿尿液中谷胱甘肽浓度的显著降低(P<0.05),说明高危婴儿体内氧化应激水平显著升高,有可能发生氧化损伤。(2)基于高锰酸钾在酸性溶液中可氧化硫醇类氨基酸产生微弱的化学发光,而甲醛可以大大增强高锰酸钾-硫醇类氨基酸氧化发光体系的发光强度这一原理,建立了一个高效液相色谱结合化学发光检测人乳中谷胱甘肽、半胱氨酸的方法。该方法具有分离效率高、检测灵敏的特点,实现了不再需要对硫醇类氨基酸衍生,直接对其检测的目的;半胱氨酸和谷胱甘肽的线性范围为0.02-10μmol/mL和0.05-10μmol/mL,并且在线性范围内都表现出了良好的线性(R~2≥0.99);半胱氨酸和谷胱甘肽的的LOD分别是0.02μmol/mL和3.7μmol/mL,对半胱氨酸和谷胱甘肽的的低、中和高浓度的加标回收率范围为96.3%-99.9%和96.1%-99.3%,表明母乳中谷胱甘肽的回收率良好;日内精度和日间精度均小于10%,符合生物样品的试验要求。采集同一城市不同城区人体母乳样本,运用新方法检测母乳中谷胱甘肽和半胱氨酸。结果发现,高污染地区谷胱甘肽和半胱氨酸浓度为0.63±0.05μg/mL、0.52±0.02μg/mL低污染地区其浓度为1.71±0.34μg/mL、1.12±0.04μg/mL,对照空气重金属(铅、砷、镉、汞)的检测数据分析两个地区的母乳样本数据,发现来自污染环境比较严重的城区母乳中的胱甘肽和半胱氨酸含量比对照组低(P<0.05),说明空气污染微小的差异提升就会导致哺乳期女性体内氧化应激水平升高。(3)建立了尿液中肠道菌群代谢物吲哚胺类物质的基于纳米纤维固相萃取结合高效液相色谱-荧光的检测方法。该方法可以省略传统萃取方式中常用的旋转蒸发浓缩吲哚类目标物的步骤,避免了其损失,提高了方法的灵敏度和准确性;褪黑素的线性范围为2-400 ng/mL,吲哚-3-丙酸、吲哚和3-甲基吲哚的线性范围为5-400 ng/mL,并且在线性范围内都表现出了良好的线性(R~2≥0.99)。褪黑素、吲哚-3-丙酸、吲哚和3-甲基吲哚的LOD分别是0.28 ng/mL、0.59 ng/mL、0.55 ng/mL和0.37 ng/mL。对吲哚类物质的低、中和高浓度的加标回收率范围为96.3%-99.5%、97.3%-99.3%、81.3%-91.3%和89.3%-93.8%。数据表明尿液中吲哚类物质的回收率良好;日内精度和日间精度均小于10%,符合生物样品的试验要求。将新方法成功应用于成年男性运动前后尿液中的吲哚类物质检测,运动前褪黑素、3-丙酸吲哚、吲哚、3-甲基吲哚的平均浓度分别为54.2±5.10 ng/mL、14.4±1.30 ng/mL、250.8±14.1 ng/mL和9.43±1.07 ng/mL,运动后其浓度分别为84.0±9.69 ng/mL、25.9±3.39 ng/mL、343.7±36.8 ng/mL和14.6±1.36 ng/mL,结果显示运动后尿液中吲哚类物质的浓度都显著高于运动前(P<0.05),说明短时间的运动应激就可导致肠道菌群代谢物发生变化。二、环境污染导致的氧化应激对儿童肠道菌群代谢物的影响分别在同一个城市的不同城区(环境污染指数高低略有不同)各选择一个地理环境、管理模式基本匹配的幼儿园,采集两个幼儿园大班儿童尿液样本。利用前述建立的生物样本中氧化应激标志物和肠道菌群代谢物检测方法体系检测儿童尿液中谷胱甘肽和吲哚类的水平。高污染城区幼儿园儿童尿中GSH的平均水平为36.3±2.25 ng/mL,低污染城区幼儿园儿童尿液中GSH的平均水平为49.4±5.27 ng/mL;统计结果表明,高污染城区幼儿园儿童尿中GSH的浓度的显著降低且两组之间具有统计学差异(P<0.05),说明高污染城区幼儿园儿童体内氧化应激水平显著升高,有可能导致氧化损伤;高污染城区幼儿园儿童尿液中褪黑素、3-丙酸吲哚和吲哚的平均浓度分别为40.8±3.42 ng/mL、195.0±22.4 ng/mL和181.3±15.0 ng/mL,低污染城区幼儿园儿童尿液中目标物的平均水平为54.0±5.02 ng/mL、113.9±22.3 ng/mL和243.7±23.4 ng/mL;MEL、IPA和IND的浓度在两组之间具有统计学差异(P<0.05);通过结果推论,以尿液中谷胱甘肽含量下降为特征表现的儿童体内氧化应激水平升高,同时会联动影响肠道微生物群宿主共代谢吲哚胺类物质水平的变化。这些结果表明即使微小的环境变化也会给人们,尤其是儿童健康带来显著的影响。三、基于聚乙烯醇/丝素蛋白静电纺丝技术的益生菌固载化研究利用静电纺丝技术通过调节各组分配比制备出包埋有植物乳杆菌[ATCC8014]的聚乙烯醇/丝素蛋白/益生菌复合生物纳米纤维材料。复合生物纳米纤维在模拟胃液胁迫2.0h后,其在新鲜液体培养基生物量不受影响;而纯益生菌在模拟胃液胁迫后,在新鲜液体培养基中不生长。比较实验表明聚乙烯醇/丝素蛋白/益生菌细胞复合生物纳米纤维材料在抗胃液胁迫的耐受能力方面显现出突出的优势。该技术为活性益生菌新制剂研究进行了有益的探索。